Ziehl-Neelsen Stain Foundation, činidla a technika

Ziehl-Neelsenova skvrna v barvící technice pro identifikaci mikroorganismů odolných vůči alkoholu (AAR). Název tohoto mikrobiologického postupu odkazuje na jeho autory: bakteriolog Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen.

Tato technika je typem diferenciálního zabarvení, které předpokládá použití různých barviv, aby se vytvořil kontrast mezi strukturami, které chcete pozorovat, rozlišovat a později identifikovat. Ziehl-Neelsenova skvrna se používá k identifikaci určitých typů mikroorganismů.

Některé z těchto mikroorganismů jsou mykobakterie (například, Mycobacterium tuberculosis), nocardias (například, Nocardia sp.) a některé jednobuněčné parazity (například, Cryptosporidium parvum). Mnoho bakterií může být klasifikováno běžnou technikou zvanou Gramovo barvení.

Některé skupiny bakterií však vyžadují další metody k jejich identifikaci. Techniky, jako je Ziehl-Neelsenovo barvení, vyžadují kombinace barviv s teplem pro fixaci první na buněčnou stěnu.

Pak následuje proces zabarvení, který umožňuje dva výsledky: rezistenci nebo citlivost na zabarvení kyselinami a alkoholy.

Index

• 1 Nadace
  • 1.1 Sekundární zbarvení
• 2 Reagencie
  • 2.1 Primární zbarvení
  • 2.2 Odbarvovací roztok
  • 2.3 Sekundární zbarvení (barvivo)
• 3 Technika
  • 3.1 Postup barvení pomocí kyseliny
• 4 Odkazy

Nadace

Základ této barvicí techniky je založen na vlastnostech těchto mikroorganismů na buněčné stěně. Stěna je tvořena typem mastných kyselin zvaných mykolové kyseliny; Ty se vyznačují velmi dlouhými řetězci.

Když mají mastné kyseliny velmi dlouhé struktury, mohou snáze zadržet barviva. Některé rody bakterií jsou velmi obtížně barvitelné barvením Gram, a to díky vysokému obsahu kyseliny mykolové v buněčné stěně.

V barvení Ziehl-Neelsen se používá fenolická sloučenina karbol fuchsin, základní barvivo. To má schopnost interakce s mastnými kyselinami buněčné stěny, což je voskovitá textura při teplotě místnosti.

Barvení karbolem fuchsinem je zlepšeno v přítomnosti tepla, protože vosk taje a molekuly barviv se pohybují rychleji do buněčné stěny..

Kyselina, která se použije později, slouží k odbarvení buněk, které nebyly zbarveny, protože jejich stěna dostatečně nesouvisí s barvivem; proto je síla kyselého odbarvovače schopna odstranit kyselé barvivo. Buňky, které odolávají tomuto zabarvení, se nazývají odolné vůči kyselinám.

Sekundární zbarvení

Po odbarvení vzorku je toto kontrastováno s dalším barvivem zvaným sekundární barvivo. Obecně se používá methylenová modř nebo malachitová zelená.

Sekundární barvivo obarví podkladový materiál a v důsledku toho vytvoří kontrast ke strukturám, které byly barveny v prvním kroku. Pouze zbarvené buňky absorbují druhé barvivo (zabarvení) a zabarvují, zatímco buňky odolné vůči kyselinám si uchovávají červenou barvu..

Tento postup se často používá pro identifikaci Mycobacterium tuberculosis a Mycobacterium leprae, které se nazývají acidorezistentní bacily.

Činidla

Primární zbarvení

Použije se karboxin 0,3% fuchsin (filtrovaný). Toto barvivo se připravuje ze směsi alkoholů: fenolu v ethanolu (90%) nebo methanolu (95%) a v této směsi se rozpustí 3 gramy bazického fuchsinu..

Decolorizing roztok

V tomto kroku můžete použít roztoky kyseliny 3% alkoholu nebo 25% kyseliny sírové.

Sekundární zbarvení (anti-barvivo)

Nejčastěji používaným barvivem pro provádění kontrastu ve vzorcích je obvykle 0,3% methylenové modři. Mohou se však použít i jiné, například 0,5% malachitová zelená.

Technika

Postup barvení kyselinou

Připravte bakteriální nátěr

Tento přípravek je vyroben na čistém a suchém sklíčku po dodržení preventivních opatření.

Sušení nátěru

Nechte uschnout při pokojové teplotě.

Vzorek se zahřívá

Vzorek musí být zahříván ohněm na podložní sklíčko níže. Fixace alkoholem může být provedena, když nátěr nebyl připraven se sputem (ošetřeným chlornanem sodným, aby se bělel) a pokud se nebude barvit okamžitě..

M. tuberculosis Odstraňuje se bělícím prostředkem a během procesu barvení. Termofixování neošetřeného sputa nebude zabíjet M. tuberculosis, zatímco fixace alkoholem je baktericidní.

Zakryjte skvrnu

Skvrna je pokryta roztokem karbol fuchsinu (primární základní barvivo).

Skvrnu zahřejte

To se provádí po dobu 5 minut. Měli byste si všimnout uvolnění páry (přibližně 60 ° C). Je důležité nepřehřívat vzorek a vyhnout se ho.

S ohledem na ohřev skvrny je třeba dbát zvýšené opatrnosti při zahřívání karbolu fuchsin, zejména pokud se barvení provádí na podnose nebo jiné nádobě, ve které byly shromážděny vysoce hořlavé chemikálie z předchozí skvrny..

Pod sklíčka by měl být nanesen pouze malý plamen pomocí osvětleného tampónu navlhčeného několika kapkami kyselého alkoholu, methanolu nebo 70% ethanolu. Vyhněte se použití velkého tamponu namočeného v ethanolu, protože to představuje nebezpečí požáru.

Umyjte skvrnu

Toto mytí by mělo být provedeno čistou vodou. Pokud voda z vodovodu není čistá, umyjte nátěr nejlépe filtrovanou nebo destilovanou vodou.

Zakryjte nátěr kyselým alkoholem

Tento kyselý alkohol by měl být 3%. Pokrytí se provádí po dobu 5 minut nebo dokud není nátěr dostatečně zbarvený, tj. Světle růžový.

Je třeba vzít v úvahu, že kyselý alkohol je hořlavý; proto musí být používán velmi opatrně. Vyhněte se blízkosti zdrojů vznícení.

Umyjte skvrnu

Praní by mělo být čisté, destilované vody.

Zakryjte nátěr barvivem

Může to být zelené malachitové (0,5%) nebo methylenové modré (0,3%) barvivo po dobu 1 nebo 2 minut, s použitím nejdelšího času, pokud je nátěr tenký..

Umyjte skvrnu

Opět se musí použít čistá voda (destilovaná).

Odpad

Zadní strana sklíčka by měla být vyčištěna a skvrna by měla být umístěna na drenážní polici tak, aby byla vysušena vzduchem (pro sušení nepoužívejte absorpční papír).

Prozkoumejte stěr v mikroskopu

Mělo by se použít 100x objektiv a ponorný olej. Systematicky snímejte stěr a zaznamenávejte příslušná pozorování.

Interpretujte výsledky

Teoreticky jsou mikroorganismy, které jsou barveny načervenalým zbarvením, považovány za pozitivní na kyselinu (AAR +)..

Naopak, pokud jsou mikroorganismy zbarveny modře nebo zeleně, v závislosti na barvivu použitém jako protibarvivo, jsou považovány za negativní kyselinu odolnou vůči alkoholu (AAR-)..

Odkazy

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Základy praktické mikrobiologie (1. vydání). Lékařští vydavatelé Jaypee Brothers.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologie s onemocněním tělesným systémem (4. vydání). Pearson vzdělání, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Úvodní mikrobiologie (1. vydání). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratorní manuál a sešit v mikrobiologii: Aplikace pro péči o pacienta (11. vydání). McGraw-Hill vzdělání.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Učebnice mikrobiologie (1. vydání). B.I. Publikace PVT.