Wright je skvrna základ, materiály, technika a použití



Skvrna Wrigtha je barvící technika vytvořená americkým patologem Jamesem Homerem Wrightem v roce 1902, od skvrny Romanowského. Jelikož Romanowskyho skvrna byla nestabilní, Wrigth včlenil methanol jako rozpouštědlo a fixační činidlo.

Toto zbarvení je polychromatické, což znamená, že vytváří několik barev v závislosti na struktuře, kterou barvivo absorbuje. Tato technika barvení byla široce používána pro provádění diferenciálního počtu bílých krvinek a studium morfologie červených krvinek, krevních destiček a leukocytů v periferní krvi a kostní dřeni..

Jeho aplikace je velmi důležitá, protože abnormality mohou být pozorovány v různých buněčných liniích krve, což usnadňuje diagnostiku onemocnění, jako jsou leukémie nebo bakteriální nebo parazitární infekce..

Možná se jedná o nejběžnější aplikace, ve kterých se tato technika používá, ale nejsou jediné. To je také užitečné ve vzorcích jiných než krev a kostní dřeň, jako jsou vzorky nosního výtoku, fekálního hlenu, sputa, kůže, mimo jiné..

Index

  • 1 Založení Wrightovy skvrny
  • 2 Materiály
    • 2.1 Příprava
    • 2.2 Pufrovaný pufrový roztok
    • 2.3 Další materiály potřebné k provedení barvení
  • 3 Součásti Wrightovy skvrny
    • 3.1 Metanol
    • 3.2 Tlumič nárazů
    • 3.3 Eosin (Y)
    • 3.4 Methylenová modř
  • 4 Technika
  • 5 Nástroje
    • 5.1 Hematologie
    • 5.2 Nosní sekrece
    • 5.3 Parazitologie
    • 5.4 Respirační infekce
    • 5.5 Bakteriologie
    • 5.6 Mykologie
  • 6 Jak jsou struktury krevního vzorku pozorovány s Wrightovou skvrnou??
  • 7 Doporučení pro dobré barvení
  • 8 Běžné chyby v barvení Wrigth
    • 8.1 Velmi světlé zabarvení
    • 8.2 Precipitáty barviva
    • 8.3 Rozmazání s extrémně načervenalým nebo modrým zbarvením
  • 9 Režim ukládání
  • 10 Odkazy

Wrightova skvrna

Wrightova skvrna se narodila ze skvrny Romanowského, která se skládá z roztoku methylalkoholu z kyselého barviva (eosin Y) a základního (methylenová modř) a jeho oxidačních produktů.

Směs barviv používaných ve Wrightově skvrně způsobuje účinek známý jako Romanowsky, to znamená, že poskytuje krásné fialové zbarvení jádra leukocytů a neutrofilních granulí, zatímco červené krvinky jsou barveny růžově..

Komponenty zodpovědné za poskytnutí barevného rozmezí, které je typické pro Wrightovo barvení, jsou modré B a eosin Y. Pozorovaný účinek bude záviset na vazbě barviv na chemické struktury a interakce modré B a eosinu Y.

Acidické struktury, jako jsou nukleové kyseliny, jaderné proteiny a reaktivní nezralá cytoplazma některých typů buněk, fixní modř B (základní barvivo).

Zatímco základní struktury, jako je hemoglobin, granule segmentovaných eozinofilů, mezi jinými buněčnými strukturami, fixují eosin Y (kyselé barvivo).

Výsledek barvení může být ovlivněn různými faktory, jako je pH barviva Wright, pufru a promývacího roztoku; stejně jako doba barvení a fixace.

Proto je každý krok přípravy činidel rozhodující a musí být prováděn s péčí o každý detail.

Materiály

Válečné zbarvení. Pro 100 ml se vyžaduje:

Naváží se 0,3 g barviva Wright, změří se 97 ml methanolu a 3 ml glycerolu.

Příprava

V maltě vložte těžké množství Wrightova barviva a pomalu přidávejte glycerol, dokud se prášek úplně nerozpustí..

Poté se přidá methanol, směs se míchá a nalije se do jantarové láhve.

Před použitím by měl být roztok protřepán jemnými pohyby a filtrován.

Pufrovaný pufr

V litru destilované vody bylo 3,76 g hydrogenfosforečnanu disodného (Na2HPO4   2H20) plus 2,1 g dihydrogenfosforečnanu draselného (KH)2PO4).

Velmi dobře promíchejte, dokud se všechna začleněná činidla nerozpustí. Upravte pH na 7,2. Nalijte do skleněné nádoby a udržujte při pokojové teplotě.

Další materiály potřebné k provedení zbarvení

Kromě toho jsou k provedení barvicí techniky zapotřebí další materiály, kterými jsou: fólie nesoucí předměty nebo kryty objektů, můstek barev, pisety s vodou nebo pufr pro mytí, stopky, které zabírají časy zbarvení a některé sušící materiály (savý papír, gáza nebo bavlna).

Barvící složky Wright

Methanol

Alkohol (metanol) slouží jako fixační prostředek na krevní nátěr na sklíčko.

V podstatě se jedná o redukční činidlo, dehydratátor a koagulační fixační činidlo. Jeho funkcí je proto koagulace proteinů a jejich nerozpustnost, ale bez jejich denaturace.

Metanol je nejrozšířenějším činidlem pro fixaci nátěrů ve všech laboratořích, protože poskytuje lepší výsledky než ty, které se získají s ethanolem. Ideální koncentrace je 99%.

Tlumič nárazů

Pufr (pufrovaný roztok) má funkci úpravy nebo udržování pH barviva, protože pH upravené na 7,2 je nezbytné pro buněčné struktury, aby správně absorbovaly barviva..

Na druhé straně, průchod fixací methanolu dehydratuje buňky a pufr je pomáhá rehydratovat.

Eosin (Y)

Eosin má afinitu k základním složkám, protože se jedná o kyselé barvivo. Dva typy eosinu jsou si navzájem velmi podobné, takže jeden z nich může být použit, čímž se dosáhne stejného výsledku.

Jeden se nazývá eosin Y, žlutý eosin nebo tetrabromofluorescein a další eosin B, modravý erythrosin B nebo dibromodinitrofluorescein. Nejčastěji se však používá eosin Y..

Nejdůležitější vlastností tohoto barviva je jeho negativní polarita, což ho přitahuje buněčnými strukturami s kladným nábojem.

Methylenová modř

Je to základní zbarvení. Její hlavní vlastností je metachromasie, to znamená, že ne všechny struktury budou barveny stejnou barvou, záleží na chemickém složení struktur, které barví..

Některé z nich se rozsvítí nebo tmavě modré a jiné tmavě fialové nebo světle fialové.

Technika

1-Proveďte rozmetání vzorku tak, aby na sklíčku nebo krycím sklíčku zůstal tenký film.

2-Nechte vzduch vyschnout asi 2 hodiny.

3-Umístěte suchý nátěr na barvicí můstek nebo barvicí misku se vzorkem vzhůru.

4 - Zakryjte list barvivem Wright po kapce, až zakryje celý povrch. Nechte působit 5 - 8 minut.

5-Barvivo by mělo zcela pokrýt sklíčko, aniž by se rozlévalo přes hrany. Pokud se během doby zbarvení začne odpařovat, je třeba umístit další kapky.

6-Následně přidejte stejné množství tlumiče, trochu vyfoukejte, dokud se neobjeví charakteristický kovový lesk. Vezměte 10 až 15 minut.

7-Umyjte vodou z vodovodu, umístěte měkký proud, dokud list nevypadne růžově.

8 - S gázou impregnovanou alkoholem odstraňte barvivo připojené k zadní části sklíčka.

9 - Před nanesením imerzního oleje do mikroskopu nechte nátěr velmi dobře vyschnout.

Utility

Hematologie

Je ideální pro rozmazávání periferních krevních nátěrů, pro zkoumání silných krevních nátěrů a pro studium buněk ze vzorků kostní dřeně.

Vzhledem k chemickým vlastnostem této kombinace barviv lze snadno rozpoznat buněčné struktury, které jsou schopny rozlišit různé typy přítomných buněk..

Nosní sekrece

Tato technika je velmi užitečná pro identifikaci buněk nosní sekrece (epitelových buněk, segmentovaných eozinofilů, polymorfonukleárních buněk) v diagnostice alergické rýmy.

Parazitologie

V tomto smyslu bylo užitečné pro studium Leishmania sp v histiocytech subkutánní buněčné tkáně v kožních vředech. Podobně se používá k identifikaci leukocytů ve vzorcích stolice (fekální leukogram).

V tomto případě je pro lékaře zajímavé zjistit, zda je leukocytóza přítomná ve výkalech polymorfonukleární nebo mononukleární. Toto zjištění ve fekálním leukogramu bude určovat, zda se jedná o bakteriální nebo virovou infekci.

Na druhé straně paraziti, kteří cirkulují v krvi, se mohou nacházet uvnitř erytrocytů nebo v plazmě. Hledaní paraziti jsou Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii a filarií a ve veterinární medicíně je užitečné při hledání Theileria equi a Babesia caballi, původci dětí, zejména u koňovitých.

Barvy Wright a Giemsa mohou diferencovat hemoparazity od normálních buněčných složek. K tomu můžete použít dva typy spreadů:

Jemné úseky

Krev je rozložena jako tenký film na sklíčku. Obarví se Wrightovou skvrnou a odhalí vlastnosti jádra a cytoplazmy.

Tlustá kapka

Tato metodika se používá ke zkoumání přítomnosti parazitů ve větším množství krve.

K tomu se na sklíčko umístí velká kapka krve. Jakmile tam budete, měli byste defibrinovat, dělat větší a větší kruhy od středu ven, pomocí okraje dalšího sklíčka.

Aby bylo možné pozorovat parazity v silném nátěru, musí být erytrocyty lyžovány vodou.

Respirační infekce

Na úrovni dýchacích cest je tato technika také užitečná, protože buňky přítomné ve vzorcích sputa, bronchiální nebo bronchoalveolární laváže jsou důležité pro stanovení diagnózy..

Podobně zde mohou být rozlišeny polymorfonukleární buňky a mononukleární buňky.

Bakteriologie

Použití této techniky v bakteriologii je omezené, protože není dobré pro barvení bakterií, proto se pro barvení používají jiné specializované barvící techniky..

Byl však použit k vyhledání epiteliálních buněk s inkluzními tělísky Chlamydia trachomatis v nátěrech uretrální nebo endocervikální sliznice, i když je třeba uznat, že to není nejlepší způsob.

Mezi červenými krvinkami lze pozorovat také bakterie spirálovitého typu Borrelia burgdorferi u infikovaných pacientů, stejně jako morulae nebo inkluzních tělísek Ehrlichia sp v cytoplazmě lymfocytů, monocytů nebo neutrofilů v krevním nátěru.

Mykologie

Histoplasma capsulatum je patogenní houba často diagnostikovaná mikroskopickým pozorováním různých vzorků tkání, obarvených Wrightovým barvivem.

Jak jsou pozorovány struktury krevního vzorku s Wrightovou skvrnou?

Doporučení pro dobré barvení

Prodloužení krevních vzorků by mělo být spontánně vysušeno na vzduchu. Šmouhy by měly být co nejtenčí, aby se dosáhlo lepší fixace barviva a zabránilo se přeplnění.

Pro vysoce kvalitní barvení se doporučuje provést barvení během dvou hodin po přípravě nátěru. Na druhé straně je ideálním vzorkem kapilární krev bez antikoagulantu.

Je-li však použita žilní krev, měla by být použita jako antikoagulant EDTA a nikoli heparin, protože tyto mohou deformovat buněčné struktury..

Aby se předešlo opotřebení připraveného barviva, mělo by být skladováno na suchém místě.

Během promývacího procesu se doporučuje použití vody upravené na neutrální pH.

Nakonec je vhodné testovat metody barvení, které se používají v laboratoři tak často.

To se provádí barvením vzorků nebo prodlouženými vzory, jako kontrola kvality. Tento krok je důležitý, protože zajišťuje, že barvení je řádně připraveno a časy zbarvení jsou dobře standardizovány.

Pokud je vzorový vzor špatně zbarven, pak existují problémy, které musí být vyřešeny.

Běžné chyby v barvení Wrigth

Velmi bledé zabarvení

Velmi bledé šmouhy, obvykle kvůli velmi krátké době barvení nebo velmi přehnané mytí. Opravuje se prodloužením doby kontaktu s barvivem nebo snížením doby praní.

Vysráží se barvivo

Přítomnost sraženin barviva v nátěru může mít několik příčin, ale nejčastější příčiny jsou: použití nefiltrovaného barviva, barvení na nerovnoměrných barevných můstcích, použití špinavých listů s prachem nebo mazivem, bez řádného praní na Dokončete barvení.

Šmouh s extrémně načervenalým nebo modrým zbarvením

Pufr je zodpovědný za pH barviva. Barviva s hodnotou pH pod uvedenou hodnotou (kyselina) budou mít za následek velmi červené skvrny.

Pokud je pH barviva nad (alkalické), získá se extrémně namodralý nátěr.

Režim ukládání

Činidlo by mělo být skladováno při pokojové teplotě.

Odkazy

  1. Gutiérrez V. Srovnávací studie mezi metodou barvení podle Wrighta a testem Elisa pro diagnostiku Ehrlichiosis canina ve městě San Pedro Sula, Honduras. Diplomová práce se uchází o titul veterinárního lékaře. Univerzita San Carlos de Guatemala.
  2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Základní barvení v mikrobiologické laboratoři. Výzkum zdravotního postižení. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Wrightova skvrna." Experimentální strojový překlad hesla Wikipedia z encyklopedie Wikipedia pořízený překladačem Eurotran. 18. května 2018, 12:05 UTC. 8. prosince 2018, 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frekvence Babesia spp. v koních montería, Córdoba (Kolumbie). Udcaactual divulgcient.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Editorial.
  6. Retamales E, Mazo V. Veřejný zdravotnický institut Vláda Chile. Doporučení pro barvení krevních nátěrů pro čtení krevního obrazu.