Gramové základy, materiály, technika a použití



Gramovo barvení je nejjednodušší a nejužitečnější technikou barvení v diagnostické mikrobiologii. Tato technika byla vytvořena dánským lékařem Hansem Christianem Gramem v roce 1884, kterému se podařilo klasifikovat bakterie v grampozitivních a gram-negativních, podle složení buněčné stěny..

Technika prošla určitými úpravami Huckerem v roce 1921, aby se stabilizovala činidla a zlepšila kvalita skvrn, takže Gramovo barvení je také známé jako Gram-Hucker..

S touto technikou je také možné pozorovat formu, kterou mají mikroorganismy, to znamená, zda se jedná o kokky, bacily, kokobacily, pleomorfní, vláknité a jiné. Stejně jako jeho distribuce v prostoru: v clusteru, v řetězci, izolovaném, ve dvojicích, v tetradech atd..

Pokud je podezření na bakteriální infekci, měla by být většina odebraných vzorků nanesena na sklíčko a obarvena Gramem pro vyšetření pod mikroskopem..

Zpráva o Gramovi bude lékaře informovat o tom, jaký typ mikroorganismu může být příčinou infekce, než získá konečný výsledek plodiny..

V některých případech je život pacienta velmi ohrožen, takže lékaři naléhavě potřebují zprávu od Grama, aby provedli empirickou léčbu, zatímco čeká na identifikaci mikroorganismu..

Například, pokud Gram odhalí, že v mozkomíšním moku jsou Gram-pozitivní koky, lékař bude počáteční terapii orientovat antibiotiky, která eliminují tento typ bakterií, podle protokolů, které jsou pro ni stanoveny..

Jakmile se konečný výsledek dostane s názvem izolovaného mikroorganismu a jeho příslušného antibiogramu, lékař vyhodnotí, zda má nebo nemá měnit terapii. Toto rozhodnutí bude provedeno na základě studie citlivosti mikroorganismu na antibiotika, která přijímá, a na vývoj pacienta..

Index

  • 1 Nadace
  • 2 Materiály
  • 3 Příprava barviv a činidel
    • 3.1 Krystalově fialový roztok
    • 3.2 Iodo-Lugol
    • 3.3 Bělení
    • 3.4 Kontrast
  • 4 Skladování reagencií
  • 5 Příprava rozprostřeného vzorku
    • 5.1 -Gram přímých vzorků
    • 5.2 -Rost plodin
  • 6 Technika
  • 7 Nástroje
  • 8 Běžné chyby
  • 9 Odkazy

Nadace

Jedná se o techniku, která představuje 4 základní kroky: barvení, fixaci mordantem, zabarvení a protiklad. Proto je tato technika kromě barvení bakterií také odlišuje.

Krystalická violeta je první použité barvivo. Má afinitu k peptidoglykanům a purpurové zbarví všechny přítomné bakterie, pak je umístěn lugol, který působí jako mordant, to znamená, že bude indukovat tvorbu nerozpustných komplexů krystalických violet-jod - ribonukleárních proteinů uvnitř buňky.

Gram-pozitivní bakterie, mající silnou stěnu peptidoglykanu, tvoří více komplexů (krystal violet-jod), proto si uchovávají barvivo.

Ovlivňuje také to, že stěna Gram-pozitivních bakterií obsahuje větší množství nenasycených kyselin, které vykazují vysokou afinitu pro oxidační činidla (Lugol)..

Mezitím mají gramnegativní bakterie tenkou vrstvu peptidoglykanu, která činí bakterie méně komplexními než grampozitivní bakterie..

Pak přichází krok odbarvení, kde se Gram pozitivní a gramnegativní bakterie chovají odlišně.

Gram-negativní bakterie obsahují vnější membránu bohatou na lipopolysacharidy, která je součástí její buněčné stěny. Tuky jsou zničeny kontaktem s alkoholem aceton, tak vnější membrána je destabilizovaná, fialový krystal být propuštěn.

To je způsob, jak je pak zbarvena safraninem nebo základním fuchsinem, přičemž barva je červená.

V případě grampozitivních bakterií odolávají zabarvení, protože bělidlo působí na uzavření pórů, což zabraňuje úniku krystalické violety / jódu..

Proto je zbarvení fialovým krystalem stabilní a není zde žádný prostor pro safranin nebo fuchsin. Kvůli tomu se tyto bakterie intenzivně modří nebo purpurové.

Materiály

Barevná sada Gram se skládá z:

  • Fialový krystal
  • Lugol
  • Acetonalkohol
  • Safranin nebo základní fuchsin

Příprava barviv a činidel

Roztok krystalické violety

Řešení A:

Fialový krystal -2 gr

Ethylalkohol 95% -20cc

Řešení B:

Oxalát amonný -0,8 g

Destilovaná voda - 80 cm3

Pro konečnou přípravu fialového krystalu by měl být roztok 1:10 zředěn destilovanou vodou a smíchán se 4 díly roztoku B. Směs je skladována 24 hodin před použitím. Filtruje se v baňce na zbarvení jantarově za použití papírového filtru.

Množství, které se použije denně, se převede do jantarové láhve s kapátkem.

Iodo-Lugol

Navážte a změřte uvedené množství každé sloučeniny následujícím způsobem:

Krystaly Iodo - 1gr

Jodid draselný - 2gr

Destilovaná voda -300 cm3

Jodid draselný se postupně ve vodě rozpouští a pak se přidává jod. Roztok se oholí na jantarově zbarvenou láhev.

Množství, které se použije denně, se převede na menší jantarovou láhev s kapátkem.

Bělení

95% ethylalkohol -50 ml

Aceton - 50 ml

Je připravena ve stejných částech. Dobře zakryjte, má tendenci se odpařovat.

Umístěte do láhve s kapátkem.

Tento přípravek zajišťuje změnu barvy v mírném časovém intervalu 5-10 sekund a je nejvíce doporučený.

Začátečníci preferují používat pouze 95% ethylalkoholu, kde změna barvy je pomalejší od 10 do 30 sekund.

Zatímco nejzkušenější mohou používat čistý aceton, kde k odbarvení dochází velmi rychle od 1 do 5 sekund.

Kontrast

Zásobní roztok Safraninu

Safranina -2,5 gr

Ethylalkohol 95% -100 cm3

Po zvážení uvedeného množství se safranin rozpustí ve 100 ml ethylalkoholu na 95%..

Pracovní roztok safraninu se připraví ze zásobního roztoku.

Za tímto účelem změřte 10 cm3 zásobního roztoku, přidejte 90 ml destilované vody, aby se dokončilo 100 ml.

Doporučuje se převést množství, které bude denně použito na jantarovou láhev s kapátkem.

Mikroorganismy, které se obarví slabě gramnegativně s Gram-Huckerovým barvivem, jako jsou určité anaerobní látky, Legionella sp, Campylobacter sp a Brucella sp, mohou být mnohem lépe obarveny, pokud se použije modifikace provedená Kopeloffem na barvení Gram-Huckerem, nazývané Gram-Kopeloffovo barvení..

Tato technika mění safraninové barvivo o základní fuchsin. Pomocí této modifikace je možné efektivně zabarvit výše uvedené mikroorganismy.

Skladování činidel

Připravená barviva by měla být skladována při pokojové teplotě.

Příprava vzorku rozprostřeného na barvu

Vzorek musí obsahovat nejméně 10%. \ T5 mikroorganismy před pozorováním mikroorganismu ve stěru je pravděpodobné. Nátěry mohou být vyrobeny z přímého vzorku nebo kultur v pevném nebo kapalném médiu.

Nátěrové hmoty by měly být rovnoměrné, dobře rozložené a ne příliš silné, aby bylo možné lépe vizualizovat přítomné struktury.

-Gram přímých vzorků

Moč gramu bez odstředivky

Míchá se a 10 μl se umístí na sklíčko. Pozorování alespoň jednoho pole bakterie / imerze ukazuje, že se jedná o infekci.

To znamená, že kultura bude mít přibližně více než 100 000 CFU / ml (10)5 CFU / ml) v 85% případů.

Tato metoda není užitečná pro počty kolonií pod 100 000 CFU.

LCR Gram

CSF by měl být odstředěn, supernatant odstraněn a peleta rozprostřena na sklíčku. Tato kapalina je za normálních podmínek sterilní; pozorování bakterií indikuje infekci.

Gram respiračních vzorků

V diagnóze bude vždy veden sputum Gram, bronchiální nebo bronchoalveolární výplach, i když může existovat celá řada mikroorganismů, kromě toho, že je užitečný typ pozorovaných buněk..

V případě sputa by měl být nátěr připraven s nejhnisavějšími částmi vzorku.

Stolička Gram

Nedoporučujeme provádět Gram na tento typ vzorků, protože nemá žádnou diagnostickou hodnotu.

-Gramové plodiny

Mohou být prováděny dvěma způsoby, z tekutých plodin a další z pevných plodin.

Tekuté plodiny

Z tekutých kultur je extrémně jednoduchý; pod zapalovačem je odebráno několik pečeně zakaleného bujónu, které jsou umístěny na čistém a suchém sklíčku, který poskytuje kruhové pohyby od středu směrem k obvodu, aby byl materiál rovnoměrně rozložen.

Nechá se samovolně vyschnout ve vzduchu. Po zaschnutí je materiál připevněn k plechu teplem. Za tímto účelem se pomocí svěrky list 3 nechá projít čtyřikrát plamenem hořáku Bunsen, přičemž dbejte na to, aby nedošlo k popálení materiálu..

List se nechá vychladnout a umístí se na barevný můstek.

Tuhé plodiny

Pro provedení prodloužení Gramova barvení z pevné kultury postupujte následovně:

Před výběrem kolonií, které mají být odebrány, je třeba připravit sklíčko a umístit dvě kapky přibližně sterilní fyziologický roztok.

Pokud původní kultivační destička obsahuje několik různých typů kolonií, vybere se izolovaná kolonie každé z nich. Každá kolonie se odebere platinovou smyčkou, aby se rozpustila ve fyziologickém roztoku, který byl předtím umístěn na sklíčko.

Kruhové pohyby jsou dány od středu k periferii, aby se kolonie rovnoměrně rozložila na sklíčku..

Nechá se samovolně vyschnout ve vzduchu. Po zaschnutí je list fixován teplem, jak bylo vysvětleno výše (plameny sklíčka zapalovačem), přičemž dbejte na to, aby nedošlo k popálení materiálu.

Tento postup musí být proveden s každým jiným typem kolonie. Na kus papíru by mělo být uvedeno pořadí pozorování, například:

Kolonie 1: Žlutá beta-hemolytická kolonie: V shlucích byly pozorovány grampozitivní koky

Kolonie 2: Krémová kolonie, bez hemolýzy: Byly pozorovány gramnegativní kokobacily.

Každý list musí být označen tak, aby věděl, co pozorujeme.

Technika

Technika barvení Gramem je velmi jednoduchá a relativně nenákladná a nemůže být vynechána v mikrobiologické laboratoři.

Totéž platí následovně:

  1. Opravte nátěr teplem a položte na barevný most.
  2. List je po dobu 1 minuty zcela zakryt fialovým sklem.
  3. Omyjte vodou. Nesušte
  4. Deska se přikryje roztokem Lugol, nechá se 1 minutu. Omyjte vodou. Nesušte.
  5. Směs se míchá 5-10 sekund s jemným mícháním v acetonovém alkoholu. Nebo položte list ve vzpřímené poloze a kapky kapky odbarvovacího prostředku na povrch odstraňte, dokud nebude zbývající fialové sklo odtaženo. Nepřekračujte.
  6. Omyjte vodou. Nesušte.
  7. Vyměňte list na barevném můstku a zakryjte 30 sekund safraninem (Gram-Hucker) nebo 1 minutou základním fuchsinem (Gram-Kopeloff)..
  8. Omyjte vodou
  9. Nechte spontánně vyschnout ve svislém vzduchu.

Po vysušení umístěte 1 kapku imerzního oleje, aby byl pozorován pod cílem 100X v optickém mikroskopu.

Utility

Tato technika umožňuje rozlišit morfotypeintiální rozdíly většiny bakterií.

Kvasinky se také vyznačují touto barvou. Vezmou křišťálově fialovou, to znamená, že Gram pozitivní.

Na druhé straně lze rozlišit grampozitivní spacotvorné bacily, ve kterých je pozorován volný prostor uvnitř bacillu, kde byl vytvořen endospore, ačkoliv spóry se nezbarví dobře. Pro použití spór se používají jiné techniky, jako je Shaeffer-Fulton.

Je třeba poznamenat, že tato skvrna neslouží ke zbarvení všech typů bakterií, to znamená, že se vyskytují případy, kdy barvení nefunguje..

V tomto případě mohou být zmíněny bakterie, které nemají buněčnou stěnu. Například: rod Mycoplasma, sféroplasty, Ureaplasma, L-formy a protoplasty.

Znečišťuje také bakterie se stěnami bohatými na kyseliny mykolové, jako jsou mykobakterie a intracelulární bakterie, jako jsou Chlamydias a Rickettsias.

Je také neefektivní barvit většinu spirochetálních bakterií.

Existují bakterie stejného rodu, které lze pozorovat ve stejném vzorku jako Gram pozitivní a jako Gram negativní. Když se to stane, nazývá se variabilní Gramovo barvení, které může být způsobeno změnou živin, teplotou, pH nebo koncentrací elektrolytů..

Časté chyby

Nadměrně bělidlo

Přehánění v kroku zabarvení může způsobit pozorování falešně gramnegativních mikroorganismů.

Neočekávejte dostatečnou dobu schnutí, abyste přidali imerzní olej:

Tato chyba způsobuje tvorbu mastných micel, což ztěžuje pozorování přítomných struktur. To se stane, když se olej spojí s molekulami vody přítomnými v nátěru.

Obraťte pořadí činidel:

Chyba, jako je tato, způsobí, že gramnegativní bakterie zobrazí fialovou, to znamená falešnou grampozitivní.

Používejte staré plodiny (pevné nebo kapalné):

To může způsobit Gram pozitivní bakterie barvit Gram negativní (falešné Gram negativní). To se děje proto, že ve starých kulturách je pravděpodobné, že jsou mrtvé nebo poškozené bakterie a za těchto podmínek bakterie nezachovávají fialový krystal..

Použijte velmi starý roztok Lugol:

Postupem času ztrácí lugol své vlastnosti a jeho barva mizí. Pokud se použije již degenerované činidlo, nebude krystalická fialová jamka dobře fixována, proto existuje možnost získat vizualizaci mikroorganismů falešně gramnegativní.

Namodralé pozadí

Správně zbarvené pozadí bude červené. Modré pozadí ukazuje, že změna barvy byla nedostatečná.

Odkazy

  1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Mikrobiologie Medical, 6. vydání McGraw-Hill, New York, USA
  2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydání). Argentina, Editorial Panamericana S.A..
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Editorial
  4. Casas-Rincón G. 1994. Obecná mykologie. 2. vydání Universidad Central de Venezuela, edice knihovny. Venezuela, Caracas.
  5. "Gramovo barvení" Experimentální strojový překlad hesla Wikipedia z encyklopedie Wikipedia pořízený překladačem Eurotran. 4. října 2018, 23:40 UTC. 9. prosince 2018, 17:11. Převzato z es.wikipedia.org.
  6. González M., González N. 2011. Příručka lékařské mikrobiologie. 2. vydání, Venezuela: Ředitelství médií a publikací Univerzity Carabobo.
  7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Základní barvení v mikrobiologické laboratoři. Výzkum zdravotního postižení. 2014; 3 (1): 10-18.