Základy barvení, techniky a použití



barvení spór je metodika používaná k barvení struktur rezistence, které tvoří některé bakteriální rody, pokud jsou v nepříznivých podmínkách; tyto struktury odpovídají způsobu přežití.

Existuje mnoho rodů, které tvoří spory; hlavní však jsou Bacillus a Clostridium. Tyto rody jsou považovány za relevantnější, protože mají patogenní druhy pro člověka.

Každý bacil může vyvolat spóru. V době barvení přípravku může být spór nalezen uvnitř bacillu (endospore) nebo mimo něj (exospore). S konvenčními barvicími technikami pro bakterie - jako je Gramovo barvení - spory zůstávají bezbarvé.

V současné době existuje několik metod pro barvení, které jsou schopny překonat hustou strukturu spór, aby ji barvily. Tyto metodiky jsou velmi rozmanité; mezi nimi můžeme zmínit Dornerovu techniku, Möellerovu skvrnu a metodiku Shaeffer-Fulton, známou také jako Wirtz-Conklin..

Ze všech zmíněných technik je metodika Shaeffer-Fulton nejpoužívanější v rutinních laboratořích. Za svůj název vděčí dvěma mikrobiologům, kteří vytvořili zbarvení v roce 1930: Alicia Shaeffer a MacDonald Fulton. Nicméně, někdy technika je volána Wirtz-Conklin ve cti dvou bakteriologists 1900s.

Index

  • 1 Nadace
  • 2 Techniky barvení spór
    • 2.1 Dornerova technika
    • 2.2 Modifikovaná Dornerova technika
    • 2.3 Technika Shaeffera-Fultona nebo Wirtze-Conklina
    • 2.4 Möellerova technika
    • 2.5 Modifikovaná technika Möeller bez ohřevu
  • 3 Použití
    • 3.1 Příklady
  • 4 Odkazy

Nadace

Výtrusy se nezbarví běžnými barvami, protože mají velmi silnou stěnu. Komplexní složení spór zabraňuje vstupu většiny barviv.

Pokud jsou spory studovány z vnějšku dovnitř, jsou pozorovány následující vrstvy: za prvé, exosporium, což je nejtenčí vnější vrstva tvořená glykoproteiny..

Pak přichází kutikula, která poskytuje odolnost vůči vysokým teplotám, následovaná kortexem složeným z peptidoglykanu. Pak je zde stěna základny, která chrání protoplasty.

Spór je dehydratovaná struktura, která obsahuje 15% kyseliny vápenaté a dipikolinové. Většina technik barvení spór je tedy založena na aplikaci tepla, takže barvivo může proniknout do tlusté struktury.

Jakmile je barva vybarvena, nemůže barvivo odstranit. V Shaefferově-Fultonově technice vstupuje malachitová zelená do vegetativních buněk a při aplikaci tepla proniká do endosporu a také do exospor..

Při promytí vodou se barvivo odstraní z vegetativní buňky. K tomu dochází, protože zelené malachitové barvivo je mírně bazické, takže se slabě váže na vegetativní buňku.

Na druhou stranu se nemůže dostat ven ze spóry a nakonec se kontrastuje s bacilem se safraninem. Tento základ platí pro ostatní techniky, ve kterých se něco podobného děje.

Techniky barvení spór

Aby se spóry skvrny, musíte mít čistou kulturu podezřelého kmene, který chcete studovat.

Kultura je vystavena extrémním teplotám po dobu 24 hodin, aby se stimuloval mikroorganismus ke sporulaci. Za tímto účelem může být kultura umístěna do sušárny při 44 ° C nebo v chladničce (8 ° C) po dobu 24 nebo 48 hodin.

Pokud zůstane příliš mnoho času při uvedených teplotách, budou pozorovány pouze exospory, protože všechny endospory opustí bacil..

Po uplynutí této doby se na čisté podložní sklíčko umístí několik kapek sterilního fyziologického roztoku. Pak se odebere malá část plodiny a provede se jemné rozprostření. 

Poté se nechá uschnout, je připevněna k teplu a je obarvena některými z technik, které jsou vysvětleny níže:

Dornerova technika

1. Připravte ve zkumavce koncentrovanou suspenzi sporulovaného mikroorganismu v destilované vodě a přidejte stejný objem filtrovaného fenolového fuchsinu Kinyoun..

2 Umístěte zkumavku do lázně s vroucí vodou po dobu 5 až 10 minut.

3 - Na čisté podložní sklíčko smíchejte kapku předchozí suspenze s kapkou 10% vodného roztoku nigrosinu, převarte a přefiltrujte..

4- Rychle prodlužte a vysušte mírným teplem.

5- Prověřte 100x cíl (ponoření).

Spóry se zbarví červeně a bakteriální buňky vypadají téměř na tmavém pozadí téměř bezbarvé.

Modifikovaná Dornerova technika

1 - Suspenze mikroorganismu se rozprostře na sklíčko a fixuje na teplo.

2 - Vzorek je potažen proužkem filtračního papíru, do kterého se přidává fichsin. Barvivo se zahřívá po dobu 5 až 7 minut plamenem Bunsenova hořáku, dokud se nevytvoří uvolňování par. Pak se papír vyjme.

3. Přípravek omyjte vodou a poté osušte savým papírem.

4- Pokryjte nátěr tenkým filmem o 10% nigrosinu, pomocí druhého sklíčka rozložte nigrosin nebo jehlu.

Zbarvení provedené spóry a bakteriemi je stejné, jako je popsáno v dosavadním stavu techniky.

Technika Shaeffer-Fulton nebo Wirtz-Conklin

1 - Vytvořte tenkou pomazánku se suspenzí sporulovaného mikroorganismu na sklíčku a upevněte ji na teplo.

2 - Zakryjte sklíčko vodným roztokem 5% malachitové zeleně (na list lze umístit filtrační papír)..

3. Zahřívejte plamen Bunsenova hořáku, aby unikla pára a odstranil plamen. Opakujte postup po dobu 6 až 10 minut. Pokud se během procedury roztok malachitové zeleně příliš odpaří, může být přidáno více.

4- Vyjměte filtrační papír (pokud byl vložen) a omyjte vodou.

5- Zakryjte sklíčko 0,5% vodným safraninem po dobu 30 sekund (některé varianty techniky používají 0,1% vodný safranin a nechte jej 3 minuty)..

S touto technikou jsou spory zelené a bacily jsou červené.

Nevýhodou je, že endospory mladých kultur se nezbarví dobře, protože vypadají velmi čiré nebo bezbarvé. Aby se tomu zabránilo, doporučuje se použít kultury po 48 hodinách inkubace.

Möellerova technika

1 Na 2 minuty zakryjte nátěr chloroformem.

2 - Chloroform se zlikviduje.

3 - Kryt 5% kyselinou chromovou po dobu 5 minut.

4. Promyjte destilovanou vodou

5- Plachta je pokryta fuchsinovým fenolovým kaprem a vystavena plameni hořáku Bunsen, dokud se nevypálí výpary; pak je několik minut z plamene odstraněn. Operace se opakuje, dokud nedosáhne 10 minut.

6. Omyjte vodou.

7. K odbarvení použijte okyselený ethanol (alkohol s kyselinou chlorovodíkovou). Zbývá 20 nebo 30 sekund.

8 Omyjte destilovanou vodou.

9 - Proti působení vrstvy methylenové modři po dobu 5 minut.

10 Omyjte destilovanou vodou.

11- Nechá se uschnout a vzorek se odebere pod mikroskopem.

Výtrusy vypadají jako červené a modré bacily. Je důležité nevdechovat výpary, protože jsou toxické a dlouhodobě mohou být karcinogenní.

Modifikovaná technika Möeller bez tepla

V roce 2007 Hayama a jeho spolupracovníci vytvořili modifikaci Möellerovy techniky. Odstranili krok zahřívání barviva a nahradili ho přidáním 2 kapek tergitidu Tergitol 7 pro každých 10 ml fuchsin-fenolického karbolického roztoku. Byly získány stejné výsledky.

Použití

Zbarvení spór poskytuje velmi cenné a užitečné informace pro identifikaci patogenu, protože přítomnost stejného, ​​jeho tvar, umístění v bacillu a schopnost deformovat vegetativní buňku jsou údaje, které mohou druh vést. v rámci určitého pohlaví.

V této souvislosti stojí za zmínku, že spory mohou být kulaté nebo oválné, mohou být umístěny ve středu nebo také v paracentrální, subterminální nebo terminální poloze..

Příklady

- Clostridium difficile tvoří oválnou sporu v koncové poloze, která deformuje bacil.

- Spore Clostridium terium Je oválný, nedeformuje bacil a nachází se na úrovni terminálu.

- Endospore Clostridium tetani to je terminál a deformuje bacillus, dávat vzhled paličky.

- Výtrusy Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy a C. septicum jsou kulaté nebo subterminální ovály a deformují bacil.

- Endospore Clostridium sordelli nachází se ve střední poloze s malou deformací.

Odkazy

  1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Návrh zjednodušené metody barvení bakteriálních spór bez použití tepelně úspěšné modifikace Moellerovy metody. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
  2. Přispěvatelé Wikipedie. Moellerova skvrna. Wikipedie, otevřená encyklopedie. 3. listopadu 2018, 03:28 UTC. Dostupné na adrese: en.wikipedia.org
  3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratorní manuál mikrobiologických technik. Katedra základních věd Akademie mikrobiologie. Národní polytechnický institut.
  4. "Endospora." Experimentální strojový překlad hesla Wikipedia z encyklopedie Wikipedia pořízený překladačem Eurotran. 25 února 2018, 10:20 UTC. 10 Jan 2019, 02:42: en.wikipedia.org
  5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J a spolupracovníci. (2006). Zaměstnanci Autonomního společenství Extremadura. Zvláštní program Svazek IV. Redakční MAD. Sevilla-Španělsko, str. 211-212.
  6. Silva M, García M, Corrales J., Ponce E. (2006) Odborný laboratorní technik, Galician Health Service (SERGAS). Konkrétní objem předmětu 2. Redakční MAD. Sevilla-Španělsko, str. 79-80.
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydání). Argentina, Editorial Panamericana S.A..
  8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Editorial