Funkce a typy endonukleáz

endonukleáz jsou enzymy, které štěpí fosfodiesterové vazby umístěné uvnitř nukleotidového řetězce. Restrikční místa endonukleáz jsou velmi různá. Některé z těchto enzymů štěpí DNA (deoxyribonukleovou kyselinu, náš genetický materiál) téměř kdekoli, to znamená, že jsou nespecifické.

Naproti tomu existuje další skupina endonukleáz, které jsou velmi specifické v oblasti nebo sekvenci, kterou budou excisovat. Tato skupina enzymů je známa jako restrikční enzymy a je velmi užitečná v molekulární biologii. V této skupině máme známé enzymy Bam HI, Eco RI a Alu I.

Oproti endonukleázám existuje další typ katalytických proteinů - exonukleáz - které jsou zodpovědné za rozbití fosfodiesterové vazby na konci řetězce.

Index

• 1 Restrikční endonukleázy
• 2 Funkce a aplikace restrikčních endonukleáz
  • 2.1 polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)
• 3 Typy restrikčních endonukleáz
  • 3.1 Typ I
  • 3.2 Typ II
  • 3.3 Typ III
  • 3.4 Typ IV
• 4 Odkazy

Restrikční endonukleázy

Restrikční endonukleázy nebo restrikční enzymy jsou katalytické proteiny, které jsou zodpovědné za štěpení fosfodiesterových vazeb uvnitř řetězce DNA ve velmi specifických sekvencích..

Tyto enzymy lze získat ve více biotechnologických společnostech a jejich použití je téměř nepostradatelné v rámci současných technik manipulace s DNA.

Restrikční endonukleázy jsou pojmenovány s použitím prvních písmen binomického vědeckého názvu organismu, ze kterého pocházejí, následovaný kmenem (toto je volitelné) a končí skupinou restrikčních enzymů, ke kterým patří. Například BamHI a EcoRI jsou široce používané endonukleázy.

Oblast DNA, kterou enzym rozeznává, se nazývá restrikční místo a je jedinečná pro každou endonukleázu, ačkoli na restrikčních místech se může shodovat několik enzymů. Toto místo obecně sestává z krátké palindromické sekvence o délce přibližně 4 až 6 párů bází, jako je AGCT (pro Alu I) a GAATTC pro Eco RI.

Palindromické sekvence jsou sekvence, které, i když jsou čteny ve směru 5 'až 3' nebo 3 'až 5', jsou identické. Například v případě EcoRI je palindromová sekvence: GAATTC a CTTAAG.

Funkce a aplikace restrikčních endonukleáz

Naštěstí pro molekulární biology vyvinuly bakterie v průběhu evoluce řadu restrikčních endonukleáz, které interně fragmentují genetický materiál..

V přírodě se tyto enzymy vyvinuly - pravděpodobně - jako systém bakteriální ochrany proti invazi cizích molekul DNA, jako jsou ty z fágů..

Za účelem rozlišení mezi vlastním a cizím genetickým materiálem mohou tyto restrikční endonukleázy rozpoznávat specifické nukleotidové sekvence. DNA, která nemá tuto sekvenci, tedy může být v bakterii nerušená.

Oproti tomu, když endonukleáza rozpozná restrikční místo, váže se na DNA a štěpí ji.

Biologové mají zájem studovat genetický materiál živých bytostí. DNA je však tvořena několika miliony párů bází. Tyto molekuly jsou extrémně dlouhé a měly by být analyzovány v malých fragmentech.

Pro splnění tohoto cíle jsou restrikční endonukleázy integrovány do různých protokolů molekulární biologie. Například, jednotlivý gen může být zachycen a replikován pro budoucí analýzu. Tento proces se nazývá "klonování" genu.

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)

Polymorfismy délky restrikčních fragmentů se týkají struktury specifických nukleotidových sekvencí v DNA, které jsou schopny rozpoznat a štěpit restrikční endonukleázy..

Díky specifičnosti enzymů je každý organismus charakterizován specifickým vzorem řezu v DNA, který pochází z fragmentu různých délek.

Typy restrikčních endonukleáz

Historicky byly restrikční endonukleázy klasifikovány do tří typů enzymů označených římskými číslicemi. V poslední době byl popsán čtvrtý typ endonukleázy.

Typ I

Nejdůležitější vlastností endonukleáz typu I je to, že se jedná o proteiny tvořené několika podjednotkami. Každá z nich funguje jako jediný proteinový komplex a obvykle má dvě podjednotky nazvané R, dvě M a jednu S.

Část S je zodpovědná za rozpoznání restrikčního místa v DNA. Podjednotka R je na druhé straně nezbytná pro štěpení a M je zodpovědný za katalyzování methylační reakce..

Existují čtyři podkategorie enzymů typu I, známé pod písmeny A, B, C a D, které se běžně používají. Tato klasifikace je založena na genetické komplementaci.

Enzymy typu I byly první restrikční endonukleázy, které byly objeveny a purifikovány. V molekulární biologii jsou však nejužitečnější typy II, které budou popsány v následující části.

Typ II

Restrikční endonukleázy typu II rozpoznávají specifické sekvence DNA a provádějí štěpení v konstantní poloze poblíž sekvence, která produkuje 5 'fosfáty a 3' hydroxyly. Ionty hořčíku jsou obvykle vyžadovány jako kofaktory (Mg)²⁺), ale existují některé, které mají mnohem specifičtější požadavky.

Strukturně se mohou objevit jako monomery, dimery nebo dokonce tetramery. Rekombinantní technologie využívá endonukleázy typu II az tohoto důvodu bylo charakterizováno více než 3500 enzymů.

Typ III

Tyto enzymové systémy se skládají ze dvou genů, nazývaných mod a res, které kódují podjednotky, které rozpoznávají DNA a pro modifikace nebo omezení. Obě podjednotky jsou nezbytné pro restrikci, což je proces zcela závislý na hydrolýze ATP.

Aby se štěpila molekula DNA, musí enzym interagovat se dvěma kopiemi nepalindromické rozpoznávací sekvence a místa musí být v opačné orientaci na substrátu. Štěpení předchází translokace DNA.

Typ IV

V poslední době byla identifikována další skupina. Systém je složen ze dvou nebo více genů, které kódují proteiny, které štěpí pouze modifikované DNA sekvence, ať je to methylovaný, hydroxymethylovaný nebo hydrosylovaný glykosyl..

Například enzym EckKMcrBC rozeznává dva dinukleotidy obecné formy RmC; purin následovaný methylovaným cytosinem, který může být oddělen několika páry bází - od 40 do téměř 3000. Štěpení probíhá přibližně 30 párů bází za místem, které enzym rozpoznává..

Odkazy

1. Burrell, M. M. (Ed.). (1993). Enzymy molekulární biologie. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., & Wilson, G. G. (2013). Restrikční enzymy typu I a jejich příbuzní. Výzkum nukleových kyselin, 42(1), 20-44.
3. Murray, P. R., Rosenthal, K.S., & Pfaller, M.A. (2017). Lékařská mikrobiologie + StudentConsult ve španělštině + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
4. Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restrikční endonukleázy při analýze a restrukturalizaci molekul DNA. Roční přehled biochemie, 44(1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Restrikční endonukleázy typu II: struktura a mechanismus. Buněčné a molekulární biologické vědy, 62(6), 685.