Agar krevní základ, použití a příprava



krevního agaru jedná se o obohacené pevné médium, diferenciální, ale ne selektivní. Používá se pro obnovu a růst velkého množství mikroorganismů z klinických vzorků nebo subkultur.

Pro očkování většiny klinických vzorků obdržených v laboratoři by měl být zařazen klasický krevní agar; kromě vzorků stolice, kde to není užitečné, pokud nejsou připraveny s určitými úpravami.

Toto kultivační médium se v podstatě skládá z obohaceného agaru a 5% krve. Základ agaru se může lišit podle potřeby, ale hlavně se bude skládat z peptonů, aminokyselin, vitamínů, masového extraktu, chloridu sodného, ​​agaru a dalších..

Pokud jde o krev, je obvykle nutné mít kontakt s bioteriem, aby se získala krev ze zvířat, jako je ovce, králík nebo kůň. To však není vždy možné a někdy se používá lidská krev.

Médium krevního agaru může být připraveno v laboratoři nebo může být zakoupeno připravené pro společnosti, které jsou mu určeny. Příprava tohoto média je jedním z nejcitlivějších, jakákoliv nedbalost v jeho přípravě bude mít za následek kontaminaci šarže.

Proto by měla být přijata všechna možná opatření a nakonec by měla být prováděna kontrola kvality inkubace při 37 ° C 1 destičku na každých 100 připravených vzorků..

Index

  • 1 Nadace
  • 2 Použití
    • 2.1 Výběr krevní skupiny
    • 2.2 Výběr typu základního agaru
    • 2.3 Použití krevního agaru podle základního média použitého pro jeho přípravu
  • 3 Příprava
    • 3.1 Zvážit a rozpustit
    • 3.2 Sterilizace
    • 3.3 Agregace krve
    • 3.4 Nalijte do Petriho misek
  • 4 Odkazy

Nadace

Již bylo zmíněno, že krevní agar je charakteristický tím, že je obohaceným, diferencovaným a neselektivním médiem. Suterén každé z těchto vlastností je vysvětlen níže.

Krevní agar je obohacené médium, protože má jako hlavní přísadu 5 -10% krve na agarové bázi. Obě sloučeniny obsahují mnoho živin a tato vlastnost umožňuje v ní růst většině kultivovatelných bakterií.

K tomuto růstu dochází bez omezení; z tohoto důvodu je neselektivní. Pokud se však do tohoto média přidávají sloučeniny, které brání růstu některých mikroorganismů a podporují růst jiných, stává se selektivním. To je případ, kdy se přidávají určité typy antibiotik nebo antimykotik.

Podobně je krevní agar diferenčním médiem, protože umožňuje rozlišit 3 typy bakterií: beta-hemolytikum, alfa-hemolytikum a gama-hemolytikum..

Beta-hemolytika jsou ty, které mají schopnost lýzovat nebo kompletně rozbít červené krvinky, tvořící kolem kolonií jasný halo, což vytváří β nebo β hemolýzu - hemolýzu a mikroorganismy se nazývají β-hemolytické.

Příklady B-hemolytických bakterií jsou Streptococcus pyogenes a Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolytika jsou ty, které provádějí částečnou hemolýzu, kde se hemoglobin oxiduje na methemoglobin, což vytváří kolem zbývajících kolonií zelenkavé zbarvení. Tento jev je znám jako hemolýza α nebo a-hemolýza a bakterie jsou klasifikovány jako a-hemolytické.

Příklady a-hemolytických bakterií jsou Streptococcus pneumoniae a Streptococcus skupiny viridans.

Konečně, tam jsou bakterie zvané gama-hemolytické nebo non-hemolytic. Ty rostou na agaru, aniž by na něm vznikaly změny, což je účinek známý jako γ-hemolýza a mikroorganismy jsou y-hemolytické.

Příklad γ-hemolytických bakterií: některé kmeny Streptococcus skupiny D (Streptococcus bovis a Enterococcus faecalis).

Použití

Kultivační médium pro krevní agar je jedním z nejčastěji používaných v mikrobiologické laboratoři.

Mezi mikroorganismy, které jsou schopny růst na krevním agarovém médiu, patří: přísné, fakultativní, mikroaerofilní, anaerobní, grampozitivní nebo gramnegativní aerobní bakterie, rychle rostoucí nebo pomalu rostoucí bakterie.

Rostou také některé bakterie, které jsou z hlediska výživy náročné nebo obtěžující, stejně jako houby a kvasinky. Podobně je užitečné subkultivovat nebo reaktivovat kmeny, které jsou metabolicky velmi slabé.

Volba krevního typu a základního agaru se však bude měnit v závislosti na pravděpodobném mikroorganismu, který je podezřelý z uzdravení, a použití plaku (kultury nebo antibiogramu)..

Výběr krevní skupiny

Krev může být jehněčí, králík, kůň nebo člověk.

Nejvíce doporučená je krev jehněčí, s některými výjimkami. Například k izolaci druhu Haemophilus, kde doporučená krev je kůň nebo králík, protože krev jehněčí má enzymy, které inhibují faktor V.

Nejméně doporučený je člověk, ale je nejpoužívanější, možná proto, že je to nejjednodušší získat. 

Krev musí být defibrinována, získána bez jakéhokoliv typu přísady a od zdravých zvířat. Pro použití lidské krve je třeba mít na paměti několik faktorů:

Pokud krev pochází od jedinců, kteří utrpěli bakteriální infekce, budou mít specifické protilátky. Za těchto podmínek je pravděpodobné, že růst některých bakterií bude inhibován.

Pokud se získá z krevní banky, obsahuje citrát a je možné, že se v jeho přítomnosti nevyskytují určité bakterie. Na druhou stranu, pokud krev pochází od pacientů, kteří užívají antibiotika, může být inhibován růst citlivých bakterií.

A pokud je krev z diabetické osoby, přebytečná glukóza interferuje se správným vývojem vzorců hemolýzy.

Volba základního typu agaru

Základní agar použitý pro přípravu krevního agaru může být velmi široký. Mezi nimi jsou: živný agar, agar s infuzí mozkového srdce, sójový agar trypticase, agar Müeller Hinton, agar Thayer Martin, agar Columbia, agar Brucella, agar Campylobacter atd..

Použití krevního agaru podle základního média použitého pro jeho přípravu

Živný agar

Tato báze je nejméně používaná, protože na ní rostou hlavně nenáročné bakterie, jako jsou enterické bacily, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, mimo jiné. Nedoporučuje se izolovat Streptococcus.

Agar pro infuzi mozku srdce (BHI)

Je jedním z nejvíce používaných jako základ krevního agaru, protože má potřebné živiny pro růst většiny bakterií, včetně Streptococcus sp a další náročné bakterie. I když není vhodné pozorovat vzorce hemolýzy.

S touto základnou se obvykle používá jehněčí krev.

Mohou být také připraveny varianty krevního agaru, kde jsou přidány jiné sloučeniny pro izolaci určitých mikroorganismů. K izolaci slouží například agar s infuzí mozkového srdce doplněný králičí krví, cystinem a glukózou Francisella tularensis.

Vzhledem k tomu, že s cystinem je telurit užitečný pro izolaci Corynebacterium diphteriae. Můžete použít lidskou nebo jehněčí krev.

První beta-hemolýza bude vypadat jako úzká halo, zatímco druhá bude mnohem širší.

Stejně tak se tato báze společně s bacitracinem, kukuřičným škrobem, koňskou krví a dalšími obohacenými doplňky (IsoVitaleX) používá k izolaci rodu Haemophilus sp z respiračních vzorků.

Také, pokud přidáte kombinaci antibiotik chloramfenikol - gentamicin nebo penicilin - streptomycin s koňskou krví, je ideální pro izolaci náročných patogenních hub, a to i při vyšším výnosu než Sabouraudův glukózový agar. To je zvláště užitečné při izolaci Histoplasma capsulatum.

Tryptivní sója

Tato báze je nejvhodnější pro lepší sledování vzoru hemolýzy a provádění diagnostických testů, jako jsou taxony optoquinu a bacitracinu. Jedná se o klasický krevní agar, který se používá rutinně.

S touto základnou můžete také připravit speciální krevní agar Corynebacterium diphteriae, cystinu a krev jehněčího.

Podobně, kombinace tohoto agaru s jehněčí krví plus kanamycin-vankomycin je ideální pro růst anaerobů, zejména Bacteroides sp.

Agar Müeller Hinton

Tento podklad doplněný krví slouží k provádění antibiogramu náročných mikroorganismů, jako je např Streptococcus sp.

Je také užitečný pro izolaci bakterií Legionella pneumophila.

Agar Thayer Martin

Toto médium je ideální jako základ pro krevní agar, pokud je podezřelý zejména rod Neisseria Neisseria meningitidis, protože N. gonorrhoeae neroste na krevním agaru.

Slouží také k provádění testů citlivosti Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Tato báze je vynikající pro očkování vzorků žaludečních biopsií při hledání Helicobacter pylori.

Médium je připraveno přidáním 7% krve jehněčího defibrinovaného antibiotiky (vankomycin, trimethoprim, amfotericin B a cefsulodin) k omezení růstu jiných typů bakterií, které mohou být přítomny..

Tato stejná báze doplněná lidskou nebo jehněčí krví, kyselinou nalidixovou a kolistinem je užitečná pro izolaci Gardnerella vaginalis. Je také ideální pro hodnocení antimikrobiální citlivosti na antibiotika stejného mikroorganismu.

Dále se používá pro přípravu krevního agaru pro kultivaci anaerobů, přidávání aminoglykosidů a vankomycinu.

Tato báze nám umožňuje řádně sledovat vzorce hemolýzy.

Brucella Agar

Toto médium použité jako základ krevního agaru spolu s přidáním vitamínu K je ideální pro pěstování anaerobních bakterií. V tomto případě se doporučuje použití jehněčí krve.

Agar Campylobacter

Médium Campylobacter doplněné 5% ovčí krve a 5 antibiotiky (cefalotin, amfotericin B, trimethoprim, polymyxin B a vankomycin) je médium používané k izolaci Campylobacter jejuni ve vzorcích stolice.

Příprava

Každý komerční dům přináší na zadní stranu obalu pokyny pro přípravu litru kultivačního média. Odpovídající výpočty mohou být provedeny pro přípravu požadovaného množství podle zvoleného základního agaru.

Naváží se a rozpustí se

Základní agar je dehydratovaný (prášek), takže musí být rozpuštěn v destilované vodě upravené na pH 7,3.

Množství indikované zvoleným základním agarem se zváží a rozpustí v odpovídajícím množství vody ve fiole, pak se zahřeje na mírné teplo a smísí se s rotujícími pohyby, dokud se veškerý prášek nerozpustí..

Sterilizujte

Po rozpuštění se sterilizuje v autoklávu při teplotě 121 ° C po dobu 20 minut.

Agregát krve

Při opuštění autoklávu se fiola nechá vychladnout, dokud teplota neklesne mezi 40 až 50 ° C; je teplota, kterou lidská kůže podporuje a zároveň agar ještě neztuhl.

Za tímto účelem se fiola dotkne ruky a pokud je teplo přijatelné, je ideální teplota přidat odpovídající množství defibrinované krve (50 ml na litr agaru). Jemně promíchejte, aby se homogenizovala.

Průchod agregátu krve je rozhodující, protože pokud se provede, když je médium velmi horké, červené krvinky se rozbijí a médium nebude sloužit k pozorování hemolýzy..

Pokud je přidán příliš chladný, budou se tvořit hrudky a povrch média nebude hladký, aby se flétna stala správně.

Nalijte do Petriho misek

Podávejte ve sterilních Petriho miskách ihned po homogenizaci krve. Do každé Petriho misky se nalije přibližně 20 ml. Tento postup se provádí v digestoři s laminárním prouděním nebo v blízkosti hořáku.

Při podávání krevního agaru v Petriho miskách by na povrchu destičky neměly zůstat žádné vzduchové bubliny. Pokud k tomu dojde, plamen Bunsenova hořáku se rychle přenese přes desku, aby se odstranil..

Destičky se nechají ztuhnout a uchovávají se v chladničce (2 - 8 ° C) obrácené až do použití. Před použitím krevních agarových destiček je třeba temperovat (nechte je vytáhnout na pokojovou teplotu), aby byly zasety.

Připravené destičky trvají přibližně 1 týden.

Odkazy

  1. Bayona M. Mikrobiologické podmínky pro pěstování. \ T Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94-99
  2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Praktická klinická mikrobiologie. Univerzita Cadiz, 2. vydání. UCA Publications Service.
  3. "Agarská krev." Experimentální strojový překlad hesla Wikipedia z encyklopedie Wikipedia pořízený překladačem Eurotran. 10. prosince 2018, 14:55 UTC. 27. prosince 2018, 01: 49 cz.wikipedia.org.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Editorial.
  5. CEDIVET Laboratorní veterinární diagnostické centrum. Guatemala K dispozici na adrese: trensa.com.
  6.  Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydání). Argentina, Editorial Panamericana S.A..