Agar Sabouraud nadace, příprava a použití



Sabouraud agar, Také známý jako Sabouraudův dextrózový agar, jedná se o pevné kultivační médium, zvláště obohacené pro izolaci a vývoj hub, jako jsou kvasinky, plísně a dermatofyty..

To znamená, že v mikrobiologické laboratoři nemůže chybět vyšetřování přítomnosti patogenních nebo oportunistických hub, a to buď z klinických nebo neklinických vzorků. Podobně je také ideální pro růst vláknitých bakterií, jako jsou Streptomyces a Nocardia. Jeho použití je velmi široké, lze jej použít v lidské, živočišné, rostlinné a průmyslové mykologii.

Toto médium vzniklo v roce 1896 renomovaným dermatologem Raimondem Sabouraudem, který se stal světově uznávaným specialistou na poruchy pokožky hlavy, způsobené především dermatofyty..

Jeho tvorba byla tak důležitá, že se od té doby používá a pokračuje dodnes, i když s některými úpravami.

I když je to pro houby zvláštní, v tomto médiu mohou bakterie růst, a proto pro vzorky se smíšenou flórou je nutné zahrnout do přípravy antibiotika a tím inhibovat růst bakteriální flóry, která může být přítomna..

Volba antibiotika by měla být prováděna s opatrností as ohledem na typ houby, kterou chcete obnovit, protože některé jsou inhibovány v přítomnosti určitých látek..

Index

  • 1 Nadace
    • 1.1 Nejpoužívanější kombinace agaru Sabouraud dextrózy s antibiotiky
  • 2 Příprava
    • 2.1 Dextrosa Sabouraud Agar 
    • 2.2 Sabouraudův dextrózový agar (modifikace Emmons)
    • 2.3 Sabouraud dextrózový agar (modifikace Emmons) chloramfenikolem
    • 2.4 Dextrosa Sabouraud Emmons agar s cykloheximidem
    • 2.5 Dextróza Sabouraud Agar (Emmons) s chloramfenikolem a cykloheximidem
    • 2.6 Další antibiotika, která mohou být přidána
  • 3 Zvláštní úvahy
  • 4 Kontrola kvality
  • 5 Použití
    • 5.1 Primární kultivace
    • 5.2 Sporulace
    • 5.3 Ochrana
    • 5.4 Mikrokultury
    • 5.5 V lidské mykologii
    • 5.6 Zvířecí mykologie
    • 5.7 Environmentální mykologie
    • 5.8 Průmyslová mykologie
    • 5.9 Rostlinná mykologie
  • 6 Odkazy

Nadace

Sabouraud dextrózový agar je médium, které je ve své původní formulaci slabě selektivní vzhledem k kyselému pH 5,6 ± 0,2, nicméně bakterie se mohou stále vyvíjet, zejména v prodloužených inkubacích.

Médium obsahuje kazeinový peptid a zvířecí tkáň štěpenou slinivkou břišní, které poskytují zdroj uhlíku a dusíku pro vývoj mikroorganismů.

Obsahuje také vysokou koncentraci glukózy, která působí jako zdroj energie, což podporuje růst hub před bakteriemi. Vše smíchané s agar-agarem, složkou, která zajišťuje správnou konzistenci.

Na druhou stranu Sabouraudův dextrózový agar může být selektivní, pokud se přidají antibiotika.

S antibiotiky je zvláště užitečný ve vzorcích ran, otevřených vředech nebo v jakémkoliv vzorku, u kterého je podezření na velkou bakteriální kontaminaci.

Nejpoužívanější kombinace agaru Sabouraud dextrózy s antibiotiky

-Sabouraud agar s chloramfenikolem: ideální pro regeneraci kvasinek a vláknitých hub.

-Sabouraud agar s gentamicinem a chloramfenikolem: v tomto médiu rostou téměř všechny vláknité houby a kvasinky a inhibuje velké množství bakterií, včetně Enterobacteria, Pseudomonas a Staphylococcus.

-Sabouraud agar s cykloheximidem: je zvláště vhodný pro vzorky z kůže nebo dýchacích cest, pokud je podezření dimorfní houby.

Cykloheximid by měl být používán s opatrností; Ačkoliv se používá k inhibici růstu nepatogenních nebo environmentálních hub a kvasinek, které mohou být ve vzorku přítomny jako kontaminanty, také inhibuje růst některých hub, jako jsou Cryptococcus neoformans,  Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp jiné oportunistické houby.

-Sabouraud agar s chloramfenikolem a cykloheximidem se používá hlavně k izolaci dimorfních dermatofytů a hub. Nevýhodou je, že inhibuje některé druhy oportunistických hub jako Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes nebo C. neoformans.

-Agar Sabouraud s chloramfenikolem, streptomycinem, penicilinem G a cykloheximidem: je ideální pro vzorky extrémně kontaminované bakteriemi a saprofytickými houbami, ale má tu nevýhodu, že inhibuje růst Actinomyces a Nocardias, kromě výše uvedených oportunistických hub.

Příprava

Máte-li složky samostatně, můžete je připravit následujícím způsobem:

Dextrózový agar Sabouraud 

Vážení:

- 40 g dextrózy

- 10 g peptonu

- 15 g agaru-agaru

- Změřte 1000 ml destilované vody

Všechny složky se smísí, pH se upraví na 5,6. Rozpuštěné látky se rozpustí vařením, rozdělí se 20 ml média do zkumavek o rozměrech 25 x 150 mm, bez příruby a nejlépe s bavlněným topem..

V závislosti na dostupnosti lze použít i jiné velikosti trubek.

Jsou autoklávovány po dobu 10 minut v tlakové atmosféře (121 ° C). Nepřekračujte dobu autoklávování. Při opouštění autoklávu se zkumavky nakloní nosičem, dokud neztuhnou v píku..

Dalším způsobem je rozpustit složky zahříváním, dokud se nerozpustí. Ve stejném autoklávu fiola po dobu 10 minut a poté 20 ml v Petriho miskách.

Pokud je k dispozici médium s dextrózovým agarem Sabouraud, které již obsahuje všechny složky, navážíme množství určené obchodním domem na jeden litr vody. Zbytek kroků je stejný jako výše popsaný postup.

Dextrózový agar Sabouraud (modifikace Emmons)

Vážení:

-  20 g dextrózy

- 10 g peptonu

-  17 g agaru-agaru

-  Změřte 1000 ml destilované vody

Všechny složky se smísí, pH se upraví na 6,9. Postupujte stejně jako v předchozím případě.

Existují komerční domy, které nabízejí médium se všemi ingrediencemi. V tomto případě se zváží a připraví způsobem popsaným ve vložce.

Sabouraud dextrózový agar (modifikace Emmons) chloramfenikolem

Zásobní roztok chloramfenikolu

- Naváží se 500 mg chloramfenikolu

- Změří se 100 ml 95% ethanolu

- Smíchejte

Médium Sabouraud dextrózového agaru (Emmons) se připraví jak je popsáno výše a navíc pro každý litr média se přidá 10 ml zásobního roztoku chloramfenikolu před autoklávováním..

Dextrózový agar Sabouraud Emmons s cykloheximidem

Zásobní roztok cykloheximidu

- Naváží se 5 g cykloheximidu

- Změří se 100 ml acetonu

- Smíchejte

Médium Sabouraudova dextrózového agaru (Emmons) se připraví, jak již bylo popsáno, a navíc pro každý litr média se přidá 10 ml zásobního roztoku cykloheximidu před autoklávováním..

Sabouraud dextrózový agar (Emmons) s chloramfenikolem a cykloheximidem

Médium Sabouraud dextrózového agaru (Emmons) se připraví jak je popsáno výše a navíc pro každý litr média se přidá 10 ml zásobního roztoku chloramfenikolu a 10 ml zásobního roztoku cykloheximidu před autoklávováním..

Další antibiotika, která mohou být přidána

20 000 až 60 000 jednotek penicilinu na litr média.

30 mg streptomycinu na litr média.

Oba by měly být zapracovány po autoklávování média, mírně ochlazeny (50-55 ° C)..

0,04 g neomycinu na litr média.

0,04 g gentamycinu na litr média.

Zvláštní úvahy

Z hlediska bezpečnosti je výhodné zasadit Sabouraudův dextrózový agar do klínovitě tvarovaných trubek (nakloněných ve vrcholu flétny) spíše než do Petriho misek, aby se zabránilo disperzi a inhalaci spór..

Je důležité, aby zkumavky s agarem Sabouraud byly pokryty bavlnou a ne šroubovacím uzávěrem, protože bylo prokázáno, že semianaerobní podmínky inhibují tvorbu spór v některých kmenech, například Coccidioides immitis. Většina hub je navíc aerobní.

Pokud používáte šroubovací uzávěr, neuzavírejte pevně.

Kontrola kvality

Připravená média musí mít kontrolu kvality, aby ověřila jejich správné fungování. Za tímto účelem se zasejí určité kontrolní kmeny.

Pro Sabouraudův dextrózový agar s chloramfenikol ATCC kmeny lze použít. Candida albicans, musí mít vynikající růst. Další destička je inokulována kmeny Escherichia coli, musí být zcela zablokován.

Inkubuje se neinokulovaná destička, ve které by nerostl žádný mikroorganismus.

Kmeny Sabouraud dextrózy s chloramfenikolem a cykloheximidem mohou být použity kmeny  Trichophyton mentagrophytes, musí dobře rozvíjet. Další destička se naočkuje kmenem kmene Aspergillus flavus, v nichž musí být malý růst nebo žádný růst. Navíc se neinokulovaná destička inkubuje, aby se prokázala její sterilita.

Pro Sabouraudův dextrózový agar s cykloheximidem, kmeny. \ T Candida albicans, Trichophyton rubrum  o Microsporum canis, který by měl vykazovat dobrý růst.

Stejně tak napětí Aspergillus flavus, vykazující malý růst nebo žádný růst. Nakonec inkubujte neinokulovanou destičku pro kontrolu sterility.

Použití

Primární kultivace

Klasický dextrózový agar Sabouraud obsahuje 4 g dextrózy a je vynikající jako primární izolační médium, protože vykazuje charakteristickou morfologii každé houby.

Je také vynikající demonstrovat výrobu pigmentů. Není to však nejvhodnější prostředek k pozorování sporulace.

Také se nedoporučuje růst Blastomyces dermatitidis, která je inhibována vysokou koncentrací přítomné glukózy.

Na druhé straně je třeba mít na paměti určité úvahy pro pěstování.

Některé houby se vyvíjejí lépe při pokojové teplotě, jako jsou plísně, jiné se vyvíjejí úspěšně při teplotě 37 ° C, jako některé kvasinky, a jiné se mohou vyvíjet při obou teplotách (dimorfní houby)..

Z tohoto důvodu je někdy nutné použít několik Sabouraudových agarových destiček pro stejný vzorek, protože jsou často vysazeny ve dvojím provedení, aby se jedna destička inkubovala při teplotě místnosti a další destička při teplotě 37 ° C..

Například, Sporothrix schenckii je zaseta do dvou desek; jedna se inkubuje při teplotě místnosti, aby se získala fáze formy, a druhá se inkubuje při teplotě 37 ° C, aby se získala fáze podobná kvasinkám, ale v druhé fázi je nutné přidat 5% krve do média..

V jiných případech, jako ve vzorcích mycetomů, se vysejí dvě destičky Sabouraudova agaru, jeden s chloramfenikolem a druhý s cykloheximidem. První umožní růst původců mycetomu plísňového původu (Eumicetoma) a druhého původce mycetomů bakteriálního původu, jako jsou aktinomycetomy..

Sporulace

Agar dextrózy Sabouraud modifikovaný Emmonsem obsahuje 2 gramy dextrózy a není používán pouze pro izolaci, ale také pro sporulaci a konzervaci hub..

V tomto médiu, pokud můžete obnovit kmeny Blastomyces dermatitidis.

Ochrana

Uchovávání houbových kultur lze uchovávat v chladničce (2–8 ° C). Doba skladování se může pohybovat mezi 2 až 8 týdny. Po uplynutí této doby musí být proces subkultivován, aby se proces opakoval.

Některé houby se nejlépe udržují při pokojové teplotě, jako je například Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum a Microsporum audounii.

Udržení kmene může být prodlouženo, aby se zabránilo pleomorfismu, pokud je dextróza zcela odstraněna z agaru a pokud je množství agaru v médiu sníženo, aby se zabránilo suchosti.

Mikrokultury

Pro identifikaci některých vláknitých hub je nutné provádět mikrokultury s použitím Sabouraudova agaru nebo jiných speciálních prostředků pro pozorování struktur sexuální a asexuální reprodukce.

V lidské mykologii

Používá se především pro diagnostiku plísňových onemocnění, zejména těch, které ovlivňují kůži a její přílohy (vlasy a nehty)..

Vzorky mohou být sekrety, exsudáty, kůže, vlasy, nehty, sputum, CSF nebo moč. Obvykle izolované patogeny jsou dermatofyty, houby, které způsobují subkutánní a systémové plísňové infekce.

Zvířecí mykologie

Zvířata jsou často postižena plísňovými infekcemi, takže agar Sabouraud je stejně užitečný ve zvířecích jako v lidské mykologii..

Například dermatofyty mohou často ovlivňovat zvířata. Takový je případ Microsporum canis var distum, často infikuje psy, kočky, koně, prasata a opice. Stejně tak, Microsporum gypseum infikuje psy, kočky a dobytek.

Ptáci jako kuřata, kohouti a kuřata jsou postiženi Microsporum gallinae.

Další houby, jako Zymonema farciminosum, jsou také příčinou onemocnění zvířat, zejména u koní, mul a oslů, což vyvolává významný zánět v lymfatických cévách.

Sporothrix schenkii a Histoplasma capsulatum ovlivňují domácí a lidská zvířata.

Environmentální mykologie

Mnoho patogenních nebo oportunistických hub může být koncentrováno v daném čase v daném prostředí, zejména v operačních sálech a jednotkách intenzivní péče (ICU) klinik a nemocnic. Proto je nutné je kontrolovat.

Dalšími zranitelnými prostory jsou knihovny a staré budovy, které mohou být ovlivněny koncentrací environmentálních hub.

V environmentálních studiích se pro izolaci hub používá Sabouraudův dextrózový agar.

Průmyslová mykologie

Sabouraud dextrózový agar nemůže chybět při studiu houbových kontaminantů při výrobě kosmetiky, potravin, nápojů, kůže, textilií, mimo jiné.

Rostlinná mykologie

Rostliny také trpí chorobami způsobenými houbami, které ovlivňují různé části rostliny, což může dokonce ukončit sklizeň, což způsobuje velké ztráty v zemědělství.

Odkazy

  1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikrobiologická diagnostika mykóz a studie citlivosti na antimykotika. Doporučení španělské společnosti infekčních nemocí a klinické mikrobiologie. K dispozici na adrese: coesant-seimc.org
  2. Laboratoř ValteK. (2009). Sabouraud dextrózový agar s cykloheximidem. Dostupné na: andinamedica.com.
  3. Navarro O. (2013). Veterinární mykologie. Národní agrární univerzita. Nikaragua.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Editorial
  5. Casas-Rincon G. Obecná mykologie. 1994. 2. ed. Universidad Central de Venezuela, edice knihovny. Venezuela, Caracas.