Agar Müeller Hinton založení, příprava a použití



Müeller Hinton agar Jedná se o pevné, neselektivní živné médium, které se skládá z masové infuze, peptidu kaseinové kyseliny, škrobu, agaru a destilované vody. Toto médium umožňuje vynikající mikrobiální vývoj většiny rychle rostoucích bakterií.

To bylo původně vytvořeno John Howard Müeller a Jane Hinton izolovat nutričně náročné bakterie, jako je Neisseria gonorrhoeae a Neisseria meningitidis. Vzhledem ke svým vlastnostem se však ukázalo jako ideální pro studium náchylnosti k antibiotikům, které poskytuje spolehlivé a reprodukovatelné výsledky..

Z tohoto důvodu je agar Müeller Hinton kultivační médium přijaté Institutem pro klinické a laboratorní standardy (CLSI) a Evropským výborem pro testování citlivosti na antimikrobiální citlivost pro provádění testu antimikrobiální citlivosti metodou Kirbyho diskové difúze. Bauer.

Index

  • 1 Nadace
  • 2 Příprava
  • 3 Použití
    • 3.1 Antimikrobiální technika
    • 3.2 Strategické umístění disků na agaru Müeller Hinton
  • 4 Příčiny chybných výsledků
  • 5 Omezení
  • 6 Kontrola kvality
  • 7 Odkazy

Nadace

Vzhledem k tomu, že se jedná o neselektivní výživné médium, je vynikající pro růst většiny patogenních bakterií.

Na druhé straně, jeho jednoduché složení umožňuje, aby na něm látky snadno difundovaly, což je podstatná charakteristika testu citlivosti metodou diskové difúze..

Další z jeho vlastností spočívá v tom, že obsahuje malé množství inhibitorů, které umožňují účinně vyhodnotit sulfonamidy, trimetoprim a tetracykliny..

Je však třeba mít na paměti, že médium musí splňovat určité podmínky, aby zajistilo jeho řádné fungování, včetně:

Úprava pH, hloubka agaru a odpovídající koncentrace thyminu, thymidinu, Ca++, Mg++ a Zn++.

Musíme také vědět, že metodika je standardizována, a proto musí být splněny všechny parametry, například:

Koncentrace inokula, koncentrace a konzervace antibiotických disků, umístění vhodného počtu disků na agaru, vzdálenost mezi jednotlivými disky, strategické umístění určitých antibiotik, atmosféra, teplota a doba inkubace.

Příprava

Naváží se 37 g dehydratovaného média Müeller Hinton a rozpustí se v 1 litru destilované vody. Médium se zahřívá za stálého míchání. Nechte vařit 1 minutu.

Autokláv se nechá sterilizovat při 121 ° C po dobu 15 minut. Při vyjímání z autoklávu se fiola musí umístit do vodní lázně o teplotě 50 ° C, aby se ochladila. Nalijte 25 až 30 ml do sterilních Petriho misek o průměru 10 cm.

Desky by měly mít průměrnou tloušťku 4 mm (ideální) s povoleným rozsahem 3-5 mm.

Pokud je žádoucí připravit krevní agar s použitím agarové báze Müeller Hinton, nalije se 5% sterilní a defibrinovaná jehněčí krev před podáváním na destičky..

Konečné pH média by mělo být mezi 7,2 až 7,4.

Investujte a uchovávejte v chladničce až do použití. Před použitím nechte destičku vytáhnout na pokojovou teplotu.

Barva připraveného média je světle béžová.

Použití

Používá se k provedení antibiogramu nebo testu citlivosti na antibiotika u většiny rychle rostoucích patogenů.

Pokud je agar doplněn krví, slouží k provedení antibiogramu náročných mikroorganismů, jako jsou: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, mimo jiné. Byl také použit k izolaci Legionella pneumophila.

Antibiogramová technika

Před provedením antibiogramu musí být připraven roztok bakterií odpovídající 1,5 x 108 buněk.

Za tím účelem se z čisté kultury odeberou 3 až 4 kolonie a suspendují se v triptikasovém sójovém bujónu nebo v bujónu Müeller Hinton, inkubují se po dobu 2 až 6 hodin a koncentrace se upraví sterilním fyziologickým roztokem ve srovnání s Mac Farland standardem. 0,5%.

Pokud požadují mikroorganismy, kolonie mohou být suspendovány přímo, dokud nedosáhnou koncentrace 0,5% Mac Farlandu. Deska Müeller Hinton se následně vyseje tampónem impregnovaným připraveným roztokem bakterií.

K tomu ponořte tampon do roztoku a potom přebytečnou kapalinu odstraňte přitlačením na stěny trubky. Ihned poté, co je tampón proplétán po celém povrchu, nezanechává žádná nedotčená místa, potom destičku lehce otočte a znovu zasejte. Operace se opakuje ještě dvakrát.

Nechte odstát po dobu 10 minut a poté vložte antibiotické disky sterilními kleštěmi, přičemž mezi nimi ponechte prostor 24 mm. Po umístění každého kotouče na agar lehce zatlačte každou z nich pomocí svorky, abyste se ujistili, že jsou dobře přilepené.

Po procesu se destička převrátí a inkubuje se při 35-37 ° C v aerobioze po dobu 16 až 18 hodin. Pokud se jedná o náročný mikroorganismus, může vyžadovat mikroaerofilii a pokud antibiogram obsahuje oxacilinové disky, měl by být čten po 24 hodinách..

Pravítko se používá k měření průměru každého halo. Výsledky by měly být zaznamenány v mm. Následně získané hodnoty korelují s tabulkami řezných bodů publikovanými aktuálním manuálem CLSI.

Jako citlivý (S), mezilehlý (I) nebo rezistentní (R), podle okolností.

Antibiotika se vybírají podle izolovaného mikroorganismu a typu infekce, která se vyskytuje.

Strategické umístění antibiotik by mělo být někdy považováno za vzor fenotypové rezistence.

Strategické umístění disků na agaru Müeller Hinton

U enterobakterií musí být kotouč kyseliny klavulanové umístěn před cefalosporiny 3. a 4. generace. Rozšíření ve tvaru vajíčka ukazuje, že kmen je producentem beta-laktamáz s rozšířeným spektrem (ESBL). To znamená, že pacient by neměl být léčen žádným cefalosporinem.

U Staphylococcus je důležité umístit erythromycin nebo azithromycin před disk clindamycinu (D-test).

Rezistentní halo v erythromycinu a zploštění v klindamycinu halo indikuje, že kmen má indukovatelnou rezistenci na klindamycin, kmen (RIC). To znamená, že léčba klindamycinem nebude účinná.

Pro vyhledávání indukovatelných AMP C kmenů v Enterobacteriaceae a některých nefermentujících gramnegativních bacilů jsou disky ceftazidimu, cefoxitinu nebo piperacilinu tazobaktanu konfrontovány s imipenemovým diskem ve vzdálenosti 27 mm..

Halom zploštěný v jednom z disků čelících imipenemu indikuje přítomnost indukovatelného AMP C.

Pro hledání konstitutivního AMP C je kloxacilinový 500 μg disk vystaven ceftazidimu (30 μg) a cefotaximu (30 μg) ve vzdálenosti 25 mm. Rozšíření halo v jednom z cefalosporinů indikuje pozitivitu.

Kloxacilinový disk může být také nahrazen 9 mm kotoučem filtračního papíru Whatman č. 6 impregnovaného kyselinou fenylboritou (400 μg) se vzdáleností 18 mm. Vykládá se stejně jako předchozí.

Konečně, zkoumání produkce metalo-beta-laktamáz, zejména v Pseudomonas aeruginosa, kotouč impregnovaný 10 μl kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA 750 μg) a kyseliny thioglykolové (SMA 300 μg), která je umístěna na discích imipenemu a meropenemu, se používá ve vzdálenosti 15 mm.

Test je pozitivní, pokud dochází k rozšíření imipenemových nebo meropenemových halo k EDTA / SMA disku. Tento výsledek musí být potvrzen modifikovaným Hodgeovým testem.

Tato metoda spočívá v inokulaci kmene Escherichia coli ATCC 25922 na desce Müeller Hinton. Imipenemový disk se umístí do středu desky a poté se z disku směrem k obvodu vytvoří drážka s napětím P. aeruginosa podezřelý Na desku můžete testovat až 4 kmeny.

Zkouška bude pozitivní, pokud je kolem strie deformační zóna imipenemového halo.

Příčiny chybných výsledků

-Disky špatně konzervovaných antibiotik mohou produkovat falešné rezistence. Například oxacilinový disk je velmi citlivý na změny teploty.

-Hodnota pH média pod hodnotou uvedené (kyselina) produkuje menší halo v aminoglykosidech a makrolidech (riziko falešné rezistence) a větší halo v penicilinu, tetracyklinu a novobiocinu (riziko falešné citlivosti).

-Pokud je hodnota pH nad uvedenou (alkalickou) hodnotou, výše popsané účinky se převrátí.

-Média s vysokými koncentracemi thyminu a thymidinu významně snižují inhibiční halos sulfonamidů a trimethoprimu.

-Vysoké koncentrace vápníku a hořčíku vyvolávají falešnou rezistenci aminoglykosidů, polymyxinu B a tetracyklinů proti kmenům Pseudomonas aeruginosa.

-Nízké koncentrace vápníku a hořčíku vyvolávají falešnou citlivost aminoglykosidů, polymyxinu B a tetracyklinů proti kmenům Pseudomonas aeruginosa.

-Přítomnost zinku ovlivňuje výsledky karbapenemových disků (imipenem, meropenem a ertapenem).

-Tloušťka média pod 3 mm vede k falešným výsledkům citlivosti, zatímco tloušťka nad 5 vyvolává falešnou rezistenci.

-Mobilizace disků v antibiogramu způsobí deformované halo, protože antibiotický výtok je okamžitý.

- Velmi slabé inokulum ovlivňují výsledky, protože na agaru nebude žádný rovnoměrný nebo konfluentní růst, což je nezbytná podmínka pro měření inhibičních zón, navíc k tomu, že halo mohou poskytnout větší než normální hodnoty.

-Přetížená inokula může způsobit menší halo než normální.

-Nerespektování vzdálenosti mezi disky způsobí, že se jeden halo překryje a nemůže být správně čten.

-Inkubujte s CO2 zvyšuje velikost halos disků tetracyklinu a methicilinu.

-Inkubace při teplotách pod 35 ° C vytváří větší halo.

-Přidání krve snižuje velikost halo sulfonamidů.

Omezení

Citlivost antibiotika prokázaná v antibiogramu proti mikroorganismu (in vitro) není zárukou, že bude fungovat in vivo.

Kontrola kvality

Chcete-li vědět, zda médium obsahuje správné množství thyminu, je třeba zasít kmen Enterococcus faecalis ATCC 29212 a testují citlivost na trimethoprim sulfamethoxazol (SXT), měl by poskytnout halo odpovídající nebo> 20 mm, aby byl uspokojivý..

Odkazy

  1. "Agar Müller-Hinton." Experimentální strojový překlad hesla Wikipedia z encyklopedie Wikipedia pořízený překladačem Eurotran. 16. listopadu 2018, 12:23 UTC. 27. 1. 2019, 04:22
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  3. Podmínky pro dobrou studii citlivosti agarovým difúzním testem. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
  4. Difco Francisco Soria Melguizo laboratoř. Müeller Hinton agar s 5% ovčí krve. 2009. Dostupné na adrese: http://f-soria.es
  5. Agarová laboratoř BD Müeller Hinton II. 2017. K dispozici na adrese: .bd.com
  6. Laboratoře Britania. Müeller Hinton agar. 2015. K dispozici na adrese: britanialab.com
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydání. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  8. Martínez-Rojas D. Betalaktamasas typ AmpC: Obecně a metody detekce fenotypů. Soc. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Dostupné na: scielo.org.
  9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypová detekce metallobetalaktamáz v klinických izolátech Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Dostupné na: scielo.org.