Agar M.R.S nadace, příprava a použití



agar M.R.S. je selektivní pevné kultivační médium, používané pro izolaci a počítání bakterií mléčného kvašení, zejména rodu Lactobacillus. Tento agar byl vytvořen v roce 1960 Manem, Rogosou a Sharpe, uprostřed nesoucím stejný název, ale vzhledem ke své složitosti se často používá zkratka M.R.S..

Skládá se z proteosového peptonu, masového extraktu, kvasničného extraktu, glukózy, monolátu sorbitanu, fosforečnanu draselného, ​​octanu sodného, ​​citrátu amonného, ​​síranu hořečnatého, síranu manganu a agaru..

Tato kompozice umožňuje správný vývoj bakterií mléčného kvašení z klinických vzorků, jako jsou výkaly, vaginální sekrece, orální vzorky a mateřské mléko, stejně jako mléčné a masné potraviny..

V klinických laboratořích se nepoužívá rutinně, protože bakterie mléčného kvašení se zřídka účastní patologických procesů. Použití agaru M.R.S je však častější v oblasti mikrobiologie potravin..

Na druhé straně toto médium používají některá výzkumná centra, jejichž cílem je studium bakterií mléčného kvašení.

Index

  • 1 Nadace
  • 2 Příprava
  • 3 Použití
    • 3.1 Charakteristika kolonií
    • 3.2 Izolace bakterií mléčného kvašení
    • 3.3 Počítání bakterií mléčného kvašení
    • 3.4 Na úrovni výzkumu
  • 4 Kontrola kvality
  • 5 Odkazy

Nadace

Agar Man, Rogosa a Sharpe má poměrně složité složení. Rozdělením funkce, kterou plní každá z jejích složek, lze vysvětlit její základ.

Proteózový pepton, masový extrakt, kvasničný extrakt a glukóza jsou živiny, které poskytují zdroj uhlíku, dusíku, vitamínů a minerálů nezbytných pro růst bakterií. Kromě toho je glukóza univerzálním zdrojem energie používaným ve většině kultivačních médií.

Na druhé straně, aby se podpořil růst bakterií mléčného kvašení, je nezbytná přítomnost nepostradatelných kofaktorů (kationtů) v metabolismu Lactobacillus a příbuzných bakterií; Tyto sloučeniny jsou soli sodíku, hořčíku a manganu.

Podobně, sorbitan monoleát nebo polysorbát 80 jsou zdrojem důležitých mastných kyselin, když jsou absorbovány jako živiny..

Kromě toho, sorbitan monoleát a amonium citrát působí inhibicí vývoje doprovodné flóry, zejména gramnegativních bakterií, které poskytují selektivní charakter tohoto agaru..

Nakonec agar-agar je to, co dává pevné konzistenci médiu.

Existují i ​​další varianty agaru Man Rogosa Sharpe; jeden z nich je doplněn cysteinem (M.R.S.c), velmi užitečným pro izolaci bifidobakterií, mezi jinými mikroorganismy. Na druhé straně je MRS médium doplněno neomycinem, paromomycinem, kyselinou nalidixovou a chloridem lithným, zejména pro selektivní počítání bifidobakterií v mléčných výrobcích..

Příprava

Naváží se 68,25 g dehydratovaného média a rozpustí se v jednom litru destilované vody. Nechte stát 5 minut. Aby se rozpustil v celém svém rozsahu, často se míchá na zdroj tepla a nechá se vařit 1 až 2 minuty. Sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut.

Když opouštíte autokláv, nechte několik minut stát a sterilizujte v horkých Petriho miskách.

Desky nechte ztuhnout a převrátit, objednat v plaquers a skladovat v chladničce až do použití. Před použitím destiček ponechte teplotu místnosti.

Hodnota pH média by měla být 6,4 ± 0,2. Některé komerční domy doporučují pH mezi 5,5 až 5,9.

Dehydratované médium je béžové a připravené je tmavě jantarové.

Dehydratované médium i připravené destičky by měly být skladovány při teplotě 2 až 8 ° C.

Použití

Agarové plotny M.R.S. mohou být zasety na povrchu (vyčerpání nebo špachtlí Drigalski). To může také být zaseto hloubkou. Destičky by měly být inkubovány při 37 ° C v mikroaerofilním prostředí (4% O2 a 5-10% CO2) po dobu 24 až 72 hodin.

Způsob výsevu se volí podle sledovaného účelu (izolace nebo počítání)..

Charakteristika kolonií

Předpokládané kolonie Lactobacillus rostou bělavě a na tomto agaru mají mukoidní nebo krémový vzhled. Pak se musí identifikovat.

Izolace bakterií mléčného kvašení

Pro tento účel se používá výsadba po povrchu. Vzorky, které mají být vysazeny, vyžadují předchozí postup. 

V případě vzorků mateřského mléka se doporučuje odstředit 1 ml vzorku při 14 000 rmp po dobu 10 minut, aby se odstranila mastná vrstva. 900 μl se odstraní a ve zbývajících 100 μl se sediment suspenduje a nalije na M.R.S. Pak musí být rovnoměrně rozložen špachtlí Drigalski.

V případě vzorků stolice se zváží jeden (1) gram stolice a homogenizuje se v 9 ml 0,1% sterilní sterilizované vody, což odpovídá 1/10 ředění. Pak se provede sériové ředění, dokud se nezíská konečné ředění 10-4.

Nakonec bylo odebráno 100 ul zředění 10-2, 10-3 a 10-4 a každé ředění se naočkuje na MRS agar, rovnoměrně se rozdělí pomocí špachtle Drigalski.

Počítání bakterií mléčného kvašení

V tomto případě se výsev provádí hloubkou.

U vzorků mateřského mléka vezměte 1 ml a vložte je do sterilní kuželové plastové zkumavky. MRS agar se přidává při teplotě přibližně 40 ° C až do konečného objemu 25 ml, čímž se získá homogenní směs. Následně se rovnoměrně nalije do sterilních Petriho misek a nechá se stát, dokud polymerizuje..

Ředění se provádí pro vzorky stolice, jak je popsáno výše. Vezměte 1 ml každého ředění a vložte do sterilních kuželových plastových zkumavek. Roztavený MRS agar se přidá do objemu 25 ml.

Směs každého ředění se rovnoměrně nalije do sterilních Petriho misek. Nakonec se nechá stát až do polymerace.

Na úrovni výzkumu

Studium bakterií mléčného kvašení je každým dnem zajímavější; zejména výzkumníci se snaží poznat nové kmeny a jejich potenciál iniciovat kvašení pro normalizaci ve výrobě mléčných výrobků, mimo jiné využití.

V tomto smyslu Alvarado et al. (2007) použil agar M.R.S. provést studii, ve které izolovali, identifikovali a charakterizovali bakterie mléčného kvašení přítomné v řemeslném uzeném venezuelském sýru.

V sýru zjistili přítomnost bakterií rodů Lactococcus a Lactobacillus a dospěli k závěru, že směsi izolovaných kmenů jsou vhodné jako startovací kmeny při výrobě sýrů z pasterizovaného mléka..

Na druhé straně, Sánchez et al. (2017) použitý agar M.R.S. zkoumat přítomnost bakterií mléčného kvašení v trávicím traktu selat za účelem jejich použití jako nativních probiotik, které zvyšují produktivitu zdravých selat.

Tímto médiem se podařilo izolovat čtyři druhy: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae a Pediococcus pentosaceus.

Podobně Báez et al. (2019) použitý agar M.R.S. vyhodnotit bakterie mléčného kvašení (BAL) a bifidobakterie s probiotickým potenciálem v mateřském mléce a výkalech kojenců.

Podařilo se jim izolovat 11 BAL a 3 Bifidobacteria sp v mateřském mléku a 8 BAL a 2 Bifidobacteria sp. ve stolici Všichni se setkali s určitými parametry, které je akreditují jako bakterie s probiotickou aktivitou.

Autoři dospěli k závěru, že mateřské mléko i výkaly výhradně kojených dětí slouží jako přírodní zdroje probiotických bakterií.

Kontrola kvality

Pro hodnocení kvality M.R.S. mohou být použity kontrolní kmeny, jako jsou:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli a Bacillus cereus.

Očekávaný výsledek je uspokojivý růst u prvních 6 bakterií E. coli a Bacillus cereus musí být zcela zablokován.

Odkazy

  1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Izolace, identifikace a charakterizace bakterií kyseliny mléčné z andského ručně vyráběného uzeného venezuelského sýra. Jeho použití jako kultivace startéru. Vědec (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Dostupné na: scielo.org.
  2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro izolace bakterií kyseliny mléčné z trávicího traktu selata. Rev. veterinář. Peru 2017; 28 (3): 730-736. Dostupné na: scielo.org.
  3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Hodnocení bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií s probiotickým potenciálem v mateřském mléce a výkalech kojenců v obci Acevedo, Miranda 2017. Bakalářská práce pro získání bakalářského titulu v oboru Bioanalýza Univerzita Carabobo, Venezuela.
  4. Britská laboratoř M.R.S agar. 2015. K dispozici na adrese: britanialab.com
  5. Přispěvatelé Wikipedie. MRS agar Wikipedie, otevřená encyklopedie. 10. ledna 2018, 19:44 UTC. Dostupné na adrese: wikipedia.org Přístupné 17. února 2019.
  6. Roy D. Média pro izolaci a výčet bifidobakterií v mléčných výrobcích. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.