Agar má standardní základ, přípravu a použití

standardní agar je pevné, neselektivní kultivační médium, určené pro kvantifikaci aerobního mikrobiálního zatížení přítomného ve vzorcích pitné vody, odpadních vod, mléčných nápojů, mimo jiné potraviny. Toto médium je také známé jako agar PCA, jeho zkratka v angličtině Plate Count Agar. To bylo vytvořeno v roce 1953 Buchbinder, Baris a Goldstein.

Standardní agarové médium se skládá z kvasničného extraktu, tripteinu, glukózy, agaru a destilované vody. Tato formulace obsahuje základní nutriční prvky, které umožňují rozvoj současné aerobní mikrobiální zátěže, která není náročná.

Protože médium neobsahuje inhibitory, bakterie se mohou vyvíjet bez jakýchkoliv omezení, takže je ideální pro celkový počet kolonií. Technika kvantifikace destiček však nezjistí všechny přítomné bakterie, ale pouze ty, které jsou schopny růst za podmínek prostředí, kterým je vystaven standardní setý agar..

V tomto smyslu se metoda kvantifikace destiček snaží obecně určit množství aerobních bakterií mezofilního typu, tj. Těch, které se vyvíjejí při teplotách mezi 25 a 40 ° C, s optimální teplotou růstu při 37 ° C..

Tato bakteriální skupina je velmi důležitá, protože pro člověka existuje většina patogenních bakterií.

Je třeba poznamenat, že někdy může být zajímavé kvantifikovat množství psychrofilních bakterií přítomných v potravinách. Tyto bakterie se vyvíjejí při nízkých teplotách (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Podobně termofilní bakterie, které se vyvíjejí v rozmezí 50 ° C až 80 ° C nebo více, mohou být důležité u některých druhů potravin, jako jsou konzervy..

Mikrobiální kvantifikace je vyjádřena v jednotkách tvořících kolonie (CFU) na gram nebo mililitr vzorku.

Index

• 1 Nadace
• 2 Příprava
  • 2.1 Technika vylévání desek
  • 2.2 Pro výsadbu
• 3 Použijte
  • 3.1 Technika lití desek (naočkována hloubkou)
  • 3.2 Technika zaseta na povrch
• 4 Kontrola kvality
• 5 Omezení
• 6 Odkazy

Nadace

Standardní počítací médium je navrženo tak, aby umožňovalo uspokojivý vývoj nenáročných aerobních bakterií, protože kvasničný extrakt, triphein a glukóza poskytují potřebné živiny pro dobrý mikrobiální vývoj..

Médium má naopak čistou barvu a transparentní vzhled, proto je ideální pro zobrazování kolonií vyvinutých metodou hlubokého setí (nalití do talíře).

Je také možné spočítat kolonie metodou výsevu na povrchu špachtlí Drigalski.

Je-li mikrobiální zátěž vysoká, musí být provedeno desetinné ředění studovaného vzorku, aby se spočítaly CFU..

Je třeba poznamenat, že toto médium je doporučeno Americkou asociací pro veřejné zdraví (APHA) pro počítání aerobních mesofilů.

Příprava

Naváží se 23,5 g dehydratovaného média a rozpustí se v jednom litru destilované vody. Pro úplné rozpuštění musí být směs často zahřívána za stálého míchání až do varu. Následující dílčí kroky závisí na použité očkovací technice.

Pro techniku ​​vylévání desek

Rozdělte 12 až 15 ml do zkumavek. Následně sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut. Nechte vertikálně ztuhnout ve formě bloku. Uchovávejte v chladničce až do použití.

Roztavte tágo, když bude použito. Po roztavení se uchovává ve vodní lázni při teplotě 44-47 ° C, zatímco se připravují vzorky.

Pro výsadbu na povrchu

Médium se sterilizuje v autoklávu při 121 ° C a pak se 20 ml rozdělí do sterilních Petriho misek. Nechte ztuhnout, převrátit a uchovávat v chladničce až do použití.

Desky před použitím temperujte. Hodnota pH média by měla být 7,0 ± 0,2.

Použití

Množství agarového standardu se používá v aerobním mezofilním počítání při mikrobiologické analýze vody a potravin. Počítání aerobních mesofilů je nezbytné, protože určuje hygienickou kvalitu studovaného vzorku.

Aplikace této techniky (pomocí tohoto média) umožňuje makroskopickou vizualizaci izolovaných kolonií pro jejich kvantifikaci.

Technika lití plaku (osazena hloubkou)

-Postup

Technika sestává z: \ t

1) Vzorek homogenizujte, aby se přítomné bakterie rozdělily.

2) Počáteční suspenze se provádí ve sterilní lahvičce nebo sáčku, přičemž se respektuje poměr 10 g nebo 10 ml vzorku v 90 ml ředidla (10^-1).

3) Z počáteční suspenze se provedou příslušná desetinná ředění v závislosti na typu vzorku. Příklad: (10)^-2, 10^-3, 10^-4). Ředění se provádí pomocí peptonové vody nebo fosfátového pufru.

Za tímto účelem vezměte 1 ml počáteční suspenze a vložte do 9 ml ředidla, v případě potřeby pokračujte v ředění, přičemž vezměte nyní 1 ml ředění.^-2 a tak dále.

4) Vezměte 1 ml každého ředění a vložte do prázdných sterilních Petriho misek.

5) Ke každé destičce se přidá 12 až 15 ml standardního množství agaru, předem roztaveného a nastaveného na 44 až 47 ° C.

6) Desky udělejte hladké rotační pohyby, aby se vzorek rovnoměrně rozdělil na agar a nechal se ztuhnout.

7) Reverzní destičky a inkubujte při teplotě 37 ° C v aerobioze po dobu 24 až 48 hodin.

8) Jakmile čas skončí, pokračujte v zkoumání destiček a spočítejte kolonie v ředění, které to umožňuje. Je zvolen pro počítání desek, které mají mezi 30 až 300 CFU.

Počítání může být provedeno ručně nebo může být použito počítadlo kolonií.

Povolené hodnoty na ml vzorku se mohou v jednotlivých zemích lišit podle norem, kterými se řídí.

-Výpočet UFC

Obecný výpočet se provádí pomocí následujícího vzorce:

Výsledky vyjádřete v 1 nebo 2 číslicích, vynásobte příslušnou bází 10. Příklad: je-li výsledek 16.545, je zaokrouhleno na třetí číslici na 17.000 a bude vyjádřeno takto: 1.7 x 10⁴. Pokud je výsledek 16 436, zaokrouhluje se na 16 000 a vyjádří se 1,6 x 10⁴.

Technika na povrchu

-Postup

-Inokulujte 0,1 ml přímého vzorku, pokud je kapalný, počáteční suspenze 10^-1 nebo po sobě následujících ředění 10^-2, 10^-3 atd., uprostřed standardní agarové desky.

-Vzorek se rovnoměrně rozetře stěrkou Drigalski nebo skleněnou tyčí ve tvaru L. Nechte stát 10 minut.

-Reverzní destičky a inkubujte v aerobioze při teplotě 37 ° C po dobu 24 až 48 hodin.

-Pokračujte v počítání kolonií, vyberte ty destičky, které jsou v rozmezí 20 - 250 CFU.

-Výpočet UFC

Pro výpočet se použije faktor ředění, který je inverzní. Číslo je zaokrouhleno na 2 významné číslice (zaokrouhleno podle třetí číslice) a je vyjádřeno v základně 10. Například, pokud se ve vzorku bez ředění spočítá 224 CFU (10^-1), Uvádí se 22 x 10¹  UFC, ale pokud bylo číslo 225, je uvedeno 23 x 10¹ UFC.

Teď, když počítáte 199 CFU v ředění 10^-3, 20 x 10⁴ UFC, ale pokud se spočítá 153 CFU ve stejném ředění, uvede se 15 x 10⁴ UFC.

Kontrola kvality

Kultivační médium standardního počtu může být vyhodnoceno pomocí známých certifikovaných kmenů, jako jsou: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Pokud je kultivační médium v ​​optimálních podmínkách, očekává se ve všech případech uspokojivý růst, s výjimkou L. fermentum které mohou mít pravidelný výkon.

Pro posouzení sterility kultivačního média by měla být jedna nebo dvě destičky z každé připravené dávky (neočkované) inkubovány při 37 ° C v aerobioze po dobu 24 hodin. Na konci této doby by neměl být pozorován růst nebo změna barvy média..

Omezení

-Agar netavte více než jednou.

-Připravené médium může trvat až 3 měsíce, pokud je uchováváno v chladničce a chráněno před světlem.

-Toto médium není vhodné pro náročné mikroorganismy ani anaerobní organismy.

Odkazy

1. Národní správa léčiv potravinářských a zdravotnických technologií (ANMAT). Mikrobiologická analýza potravin, oficiální analytická metodika, indikátorové mikroorganismy. 2014 Svazek 3. K dispozici na: anmat.gov.ar
2. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories, S.A. Plate Count Agar. 2009. Dostupné na adrese: http://f-soria.es
3. Laboratoře Conda Pronadisa. Agar pro standardní metody (PCA) podle APHA a ISO 4833. K dispozici na: condalab.com
4. Laboratoře Britania. Počítání na agarové plotně. 2015. K dispozici na adrese: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B a Velázquez O. 2009. Techniky mikrobiologické analýzy potravin. 2. ed. Fakulta chemická, UNAM. Mexiko K dispozici na adrese: depa.fquim.unam