Voges-Proskauer test základ, příprava a použití



Voges-Proskauerův test je biochemický test, který se používá k identifikaci bakterií patřících do čeledi Enterobacteriaceae. Zvláště je užitečné rozlišovat kmeny Escherichia coli z Klebsiella a Enterobacter, mimo jiné.

Test se provádí v kapalném kultivačním médiu zvaném methyl red-Voges Proskauer, lépe známý pod zkratkou RM / VP. Toto médium se skládá z pufrovaného polypeptidu, glukózy, fosforečnanu draselného a destilované vody.

Současné médium RM / VP je modifikací média Clark a Lubs, které původně obsahovalo nižší koncentraci peptonů a glukózy. Proto bylo vytvořeno méně vodíkových iontů, které jsou potřebné pro pozitivní reakci Voges-Proskauerovy reakce.

Test je založen na schopnosti mikroorganismu používat glukózu cestou butylenglykolu a tvořit neutrální konečný produkt zvaný acetoin v přítomnosti kyslíku a alkalického pH..

V médiu RM / VP se kromě toho, že je schopen odhalit Voges-Proskauerův test, může být také stanoven test methylčerveně..

Index

  • 1 Nadace
    • 1.1 Základy Voges-Proskauerova testu
    • 1.2 Základ pro vypracování testu a interpretace
  • 2 Příprava
    • 2.1 Médium RM / VP
    • 2.2 Činidlo Voges A
    • 2.3 Činidlo Voges B
  • 3 Postup testu Voges-Proskauer
    • 3.1 Vývoj testu
  • 4 Použijte
  • 5 Kontrola kvality
  • 6 Odkazy

Nadace

Základy Voges-Proskauerova testu

Pluripeptony přítomné v médiu poskytují nutriční požadavky nezbytné pro růst bakterií. Hlavní složkou je glukóza. Mnoho bakterií má schopnost metabolizovat glukózu a tvořit kyselinu pyrohroznovou.

Kyselina pyrohroznová je středním bodem metabolismu glukózy a odtud každý mikroorganismus může mít různé cesty. Některé budou tvořit smíšené kyseliny, jako je kyselina mléčná, kyselina octová, kyselina mravenčí a kyselina jantarová, a jiné budou tvořit neutrální produkty, jako je 2,3-butandiol..

Voges-Proskauerův test odhaluje schopnost mikroorganismu tvořit acetylmethylkarbinol (acetoin), meziprodukt produktu 2,3-butandiolu za aerobních podmínek.

Acetoin je redukován a tvoří 2,3-butandiol, ale tato reakce je reverzibilní, takže pokud je 2,3-butandiol oxidován, vzniká acetoin. Proto je nezbytný kyslík.

Fosfát draselný je pufr, který vlhčí směs při pH 6,9 ± 0,2..

Základ pro vypracování testu a interpretace

Pro prokázání reakce musí být vývoj proveden za použití dvou činidel (Barritova činidla) známého jako Voges A a Voges B.

Voges A je 5% roztok a-naftolu a Voges B je 40% roztok hydroxidu draselného. Pokud hydroxid draselný není k dispozici, může být nahrazen 40% hydroxidem sodným.

Α-naftol je katalyzátor, který zvýší intenzitu barvy reakce, což činí test citlivějším. Α-naftol musí být vždy přidáván jako první, přičemž se trubka míchá tak, aby se médium dostalo do styku s kyslíkem. Tímto způsobem je přítomný acetoin oxidován na diacetyl a 2,3-butandiol je oxidován na acetoin, který ho předává do diacetylu..

To je, jak se α-naftol váže na diacetyl, který je zase spojen s guanidinovým jádrem přítomným v aminokyselině argininu, který pochází z pluripeptonů.

Hydroxid draselný nebo sodný je zodpovědný za pohlcování CO2 a reagují s peptony. Tato reakce způsobuje tvorbu růžovo-lososové barvy, jasně viditelné po velmi dobrém protřepání zkumavky.

Aby došlo k okamžitému zbarvení, musí se smíchat správná množství diacetylu, peptonu a a-naftolu. Pokud k tomu nedojde, nechte zkumavku před tlumočením 15 minut odpočívat.

Obvykle je test pozitivní po 2 až 5 minutách, kdy lze pozorovat slabé růžové zabarvení. Pokud zůstane v klidu po dobu 30 minut až 1 hodiny, bude intenzita barvy maximální (tmavě červená).

Negativní test bude patrný, když je vývar žlutý. Po 1 hodině, pokud je zkouška negativní, může být v důsledku reakce hydroxidu draselného na α-naftolu vytvořena barva mědi..

Příprava

Střední RM / VP

Naváží se 17 g dehydratovaného kultivačního média a rozpustí se v jednom litru destilované vody. Nechte stát 5 minut. Zahřívejte až do varu k úplnému rozpuštění. Podávejte 3 až 4 ml v zkumavkách a sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut.

Dehydratované kultivační médium je béžové a připravené médium je světle jantarové.

Konečné pH média je 6,9 ​​± 0,2.

Činidlo Voges A

Naváží se 5 g α-naftolu a rozpustí se v 50 ml ethylalkoholu (absolutně). Následně pokračujte v přidávání ethylalkoholu do 100 ml.

Činidlo Voges B

Naváží se 40 g hydroxidu draselného a rozpustí se v 50 ml destilované vody v kádince. Sklo by mělo být umístěno ve studené vodní lázni, aby se regulovala teplota, protože v době rozpuštění přípravek prudce stoupá.

Poté, co je roztok studený, se převede na odměrný balónek a doplní se na 100 ml destilovanou vodou.

Postup Voges-Proskauerova testu

Pro provedení Voges-Proskauerova testu se bujón RM / VP naočkuje studovaným mikroorganismem z čisté kultury 18 až 24 hodin..

Inokulum by nemělo být příliš husté. Inkubuje se při teplotě 35-37 ° C po dobu 24 až 48 hodin, i když někdy je nutná inkubace po několik dní. Cowan a Steel věří, že 5 dní je minimální inkubační doba nezbytná k detekci všech pozitivních druhů Voges-Proskauer (VP) z čeledi Enterobacteriaceae.

Vývoj testu

Alikvotní podíl o objemu 1 ml se oddělí v zkumavce a provede se následující postup: umístí se 12 kapek (0,6 ml) činidla Voges A a 4 kapky (0,2 ml) přípravku Voges B. Promíchá se, aby se provzdušnilo a nechalo se stát. před provedením. Pokud je však test stále negativní, nechte stát a pozorujte zkumavku po 30 minutách až 1 hodině.

Vzhled růžově červené barvy ukazuje, že Voges-Proskauerova reakce je pozitivní. Pokud médium zůstane žluté, reakce je negativní.

Přidání vývojářů v uvedeném pořadí a množství je nezbytné, aby se zabránilo falešným negativům.

Použití

Voges-Proskauerův test je užitečný pro rozlišení mezi kmeny E. coli které jsou VP negativní, z rodů Klebsiella, Enterobacter, Serratia, mimo jiné, které jsou VP pozitivní.

Kontrola kvality

Kontrolní kmeny mohou být použity pro testování kvality připraveného média. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium a. \ T Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Očekávané výsledky jsou pozitivní Voges-Proskauerovy reakce pouze pro K. pneumoniae a E. cloacae. Zbytek dává negativní reakce.

Odkazy

  1. Laboratoře Britania. MR-VP Medium. 2015. Dostupné na adrese: www.britanialab.com
  2. Laboratoře Microkit M-Ident Voges Proskauer. 2014. K dispozici: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. ed. Redakční Panamericana. Buenos Aires Argentina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydání. Redakční Panamericana S.A. Argentina.