Podíl:
DNA sekvenování Maxam-Gilbert, Sangerova metoda, příklady
Sekvenování DNA (deoxyribonukleová kyselina) je postup prováděný v laboratořích molekulární biologie, který umožňuje znát pořadí nukleotidů v příslušném genetickém materiálu. Navíc může být také odhaleno sekvenování RNA (ribonukleová kyselina).
Tato technika byla nepostradatelná pro rozvoj biologických věd. Je také použitelná v jiných oblastech znalostí - jako je například lékařská diagnostika a forenzní vyšetřování.
Dříve bylo sekvenování řetězce DNA považováno za pomalou a nákladnou aktivitu, která umožnila identifikaci pouze několika párů bází v oligonukleotidech.
V současné době, se všemi pokroky vědy, DNA sekvenování je rutinní operace v mnoha laboratořích po celém světě díky příspěvku téměř 50 let výzkumu v této oblasti. Pokud jde o délku řetězu, můžete sekvenci až miliony párů bází ve velmi krátkém čase.
K tomu existují desítky vyvinutých technik, které se liší cenou a přesností. V tomto článku se budeme zabývat jak klasickými, tak moderními technikami, z nichž každá má své výhody a nevýhody.
Techniky sekvencování doposud umožňují získat sekvenci kompletních genomů, od malých prokaryot a kvasinek po lidský genom.
Index
- 1 Struktura DNA
- 2 Historie
- 3 Sangerova metoda
- 3.1 Hlavní složky reakce
- 3.2 Čtení výsledků
- 4 Automatické sekvenování
- 5 Maxam-Gilbertovo sekvenování
- 5.1 Postup
- 5.2 Čtení výsledků
- 6 Masivní sekvenování
- 6.1 Pyrosekvenování
- 6.2 Sekvenování syntézou
- 6.3 Sekvenování ligací
- 6.4 Sekvence Ion Torrent
- 7 Příklady
- 7.1 Sekvenování lidského genomu
- 8 Význam a aplikace
- 9 Odkazy
Struktura DNA
Pro pochopení metod a technik používaných pro sekvenování DNA je nutné znát určité klíčové aspekty struktury a složení molekuly.
DNA je biomolekula, která se nachází ve všech živých organismech, od bakterií po velké vodní živočichy. Organely - jako mitochondrie a chloroplasty - mají v sobě kruhovou molekulu DNA. I v některých virech je genetickým materiálem DNA.
Strukturálně je DNA soubor nukleotidů. Každý z nich je integrován sacharidem, dusíkatou bází (A, T, C nebo G) a fosfátovou skupinou. Cílem sekvenování DNA je odhalit pořadí, ve kterém jsou v sekvenci nalezeny čtyři dusíkaté báze.
Historie
V polovině padesátých let popsali vědci Watson a Crick strukturu DNA pomocí Christologických technik. Žádný z těchto výzkumníků však nebyl schopen najít způsob, jak tuto sekvenci odhalit.
Ačkoli tam byli jistí předchůdcové, nejdůležitější událost byla vytvoření Sangerovy metody, v roce 1977. Frederick Sanger, otec metody, byl britský biochemik, vítěz dvou Nobelových cen za jeho obrovské příspěvky k biologickým vědám..
Tato technika je také v literatuře známa jako "ukončení řetězce" nebo dideoxynukleotidy. Dále popíšeme principy této techniky a ty, které byly vyvinuty na základě zdokonalení a inovace.
Sangerova metoda
Vývoj Sangerovy metody představoval klíčovou událost v molekulární biologii. Zahrnuje základní složky procesu replikace DNA, který se normálně vyskytuje v buňce, ale přidáním speciální složky: dideoxynukleotidy.
Hlavní složky reakce
- DNA polymeráza: enzym DNA polymeráza je klíčovým prvkem procesu. Tato molekula se podílí na replikaci řetězce DNA a jeho úlohou je syntéza nového řetězce, což odpovídá trifosfátu deoxyribonukleotidů s komplementárními..
Pamatujte, že v DNA jsou thyminy (T) spárovány s adeniny (A) pomocí dvou vodíkových vazeb, zatímco cytosin (C) s guaninem (G) působí třemi můstky.
- Nukleotidy: Sangerovo sekvenování zahrnuje dva typy nukleotidů, čtyři 2'-deoxynukleotidy (zkráceně dATP, dGTP, dCTP a dTTP) a čtyři dideoxynukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP).
Ačkoliv jsou dideoxynukleotidy podobné monomerům, které jsou normálně inkorporovány do DNA, nemají ve své struktuře skupinu -OH. To znemožňuje přidání nového nukleotidu do řetězce.
Když je tedy ke vzniku řetězce přidán speciální nukleotid - zcela náhodným způsobem - syntéza je paralyzována. Tímto způsobem jsou na konci reakce řetězce různých velikostí, z nichž každá je zastavena v jiném místě.
Experimentálně jsou připraveny čtyři pokusy. Každý obsahuje DNA extrahovanou z biologického vzorku, který je předmětem zájmu, normální nukleotidy a jeden ze čtyř typů speciálních nukleotidů. Nebo jsou speciální nukleotidy označeny nějakým typem fluorescenčního markeru (viz níže automatizované sekvenování).
Čtení výsledků
Prvním krokem je oddělení každého ze syntetizovaných řetězců podle jejich velikosti. Některé budou delší než jiné, v závislosti na tom, kde byly speciální základny začleněny.
Existují různé biochemické techniky, které umožňují separaci složek směsi použitím velikosti jako diskriminační vlastnosti. V Sangerově metodě jsou různé řetězce odděleny elektroforézou. V nejsofistikovanějších variantách techniky se používá kapilární elektroforéza.
Delší řetězce se tedy pohybují méně než kratší varianty. Potom tento systém prochází čtenářem, který rozpoznává marker obsažený v každém dideoxynukleotidu. Tímto způsobem může být známo pořadí sekvence.
Tato technika "první generace" je schopna číst fragmenty DNA ne větší než 1 kilobáze. V současné době je Sangerova metoda používána v několika laboratořích, obecně v jejích moderních variantách. Kromě toho se používá k potvrzení výsledků získaných nejsložitějšími technikami - ale méně přesných.
Automatické řazení
Je-li nutné velké sekvenování, proces se urychlí automatizací. Jedná se o variantu metody ukončení Sangerova řetězce, kde jsou primery označeny fluorescenčními produkty za účelem jejich rozlišení.
Následně se produkt reakce provádí elektroforézou - to vše v jediném pruhu. Když každý fragment opustí poslední část gelu, je rychle identifikován fluorescenční značkou s chybou, která obklopuje 1%.
Nejsofistikovanější systémy mají systém až 96 kapilárních trubek ovládaných počítačem spojeným s robotem. To znamená, že 96 vzorků DNA může být hodnoceno současně. Proces zahrnující elektroforézu a analýza výsledků je tedy zcela automatizovaný.
Za jeden den mohou tyto systémy sekvenovat až 550 000 bází. Během procesu je lidská práce zbytečná, spuštění metody trvá pouze asi 15 minut.
Sekvenování Maxam-Gilbertem
Ve stejné době, kdy Sanger publikoval svou práci, se dvěma výzkumníkům jménem Allan Maxan a Walter Gilbert podařilo vyvinout další metodu získávání DNA sekvence. Metoda získala v té době popularitu, ale později byla vysídlena zlepšením Sangerovy metody.
Na rozdíl od Sangerovy metody nezahrnuje sekvenování Maxana a Gilberta (nebo chemického sekvenování, jak je také známo) hybridizační reakce. Metodika spočívá ve značení reaktivními činidly na jednom konci, po němž následuje proces čištění.
Jedním z negativních aspektů této techniky je její obrovská složitost a použití chemických látek, které jsou pro uživatele nebezpečné. Chemické poruchy jsou vyvolány aplikací DMS, kyseliny mravenčí, hydrazinu a hydrazinu se solemi.
Postup
Protokol začíná značením na 5 'konci řetězce fosforovým markerem 32, potom dochází k chemické modifikaci dusíkaté báze a je oddělena. Nakonec dochází k dělení abazické oblasti.
Nejprve se řetězec, který má být sekvenován, zkracuje na menší segmenty. Tento krok se provádí restrikčními enzymy, což vede k vynikajícím extrémům.
Dále se reakce provádí alkalickou fosfatázou, jejímž účelem je eliminovat fosfátovou skupinu. Pro provedení značení tak může být použita polynukleotidová kináza.
Řetěz je denaturován (obě vlákna jsou otevřená). Pak pokračujeme v aplikaci chemikálií. Tyto štěpné reakce jsou prováděny řízeným způsobem a jaké typy vazeb jsou rozbité každou aplikovanou chemikálií.
Čtení výsledků
Stejně jako v Sangerově metodě, čtení výsledků zahrnuje separaci podle velikosti řetězců získaných v elektroforetickém systému. Systémy složené z polyakrylamidu umožňují získat velmi vhodné rozlišení pro čtení gelu.
Masivní sekvenování
Masivní sekvenování zahrnuje řadu nových metod, zkráceně NGS, z angličtiny "Sekvenování další generace ".
Metody katalogizované jako NGS vyžadují předchozí krok amplifikace DNA (nepracují s jednou molekulou). Kromě toho se používané platformy značně liší. Principy nejoblíbenějších metod budou popsány níže:
Pyrosekvenování
Zahrnuje monitorování uvolňování pyrofosfátu, ke kterému dochází pokaždé, když je k DNA řetězci přidán nový nukleotid. Enzymový systém je spojen tak, že k emisi světla (která je detekovatelná kamerou) dochází vždy, když je začleněn nový nukleotid.
Proces začíná samostatnou inkubací každé dusíkaté báze, aby se ověřilo, zda dochází k vyzařování světla. Pyrosequencing může provádět čtení dlouhých řetězců, ale zjištěná chybovost je vysoká.
Sekvenování syntézou
To zahrnuje začlenění značených nukleotidů. Tyto fluorescenční složky se přidají, promyjí a inkorporovaný nukleotid se zaznamená. Pak je nukleotidové značení eliminováno a syntéza řetězce může pokračovat. V dalším kroku bude také začleněn značený nukleotid a uvedené kroky budou opakovány.
Nevýhodou této techniky je, že fluorescenční markery nejsou zcela eliminovány. Tyto emise vytvářejí chyby na pozadí, což vede k významným chybám.
Sekvenování ligací
Tato technika se liší od ostatních, protože nepoužívá DNA polymerázu. Klíčovým enzymem pro tuto metodologii je ligáza. Zde se používají fragmenty DNA fluorescenčně značené, jsou vázány enzymem a jsou detekovány.
Největším problémem této techniky je velmi krátká délka fragmentu, která je schopna zpracování.
Ion Sequencing Torrent
Tato technika je založena na měření H iontu+ který se uvolní při každém vložení nového nukleotidu. Princip je poměrně podobný pyrosekvenování, ale mnohem levnější.
Příklady
Sekvenování lidského genomu
Sekvenování genomu člověka je jednou z nejslibnějších výzev v biologii, stejně jako je jedním z nejuznávanějších soupeření v historii vědy. Ve skutečnosti, pro vědce zapojené do projektu, sekvenování genomu se stalo soutěží.
V roce 1990 začal s projektem "lidský genom", vedeným slavným vědcem, nositelem Nobelovy ceny Jamesem Watsonem. Po roce, v roce 1991, se Venter vydává na výzvu "bití" Watsona a sekvenování genomu před ním. Nicméně, v roce 1992, Watson odešel a příkaz byl vzat jiným výzkumníkem.
V roce 1995 oznámil Venter svůj úspěch v kompletním sekvenování bakteriálního genomu metodou náhodného sekvenování. Podobně i opoziční tým o rok později oznámil sekvenování genomu kvasinek.
V roce 2000 byl závod ukončen. Obě společnosti zveřejnily své předběžné výsledky kompletního genomu ve dvou z nejprestižnějších vědeckých časopisů: Příroda a Věda.
Nicméně, vědci pokračovali v práci na zlepšování návrhů, a v roce 2006 sekvence byly dokončeny některé lidské chromosomy.
Význam a aplikace
Znalost řádu nukleotidů molekuly tak důležitá jako DNA je cenná pro biology a příbuzné odborníky. Tento řetězec polynukleotidů obsahuje všechny informace nezbytné pro vývoj a udržování všech forem života.
Z těchto důvodů je znalost této sekvence nezbytná pro biologický výzkum. Sekvenování nám v zásadě umožňuje měřit jednu z nejdůležitějších vlastností biologických systémů a stanovit rozdíly mezi nimi.
Sekvenování je široce používáno taxonomisty a systémovými statistikami, protože určité sekvence DNA umožňují stanovit kritéria pro závěr, zda dva organismy patří ke stejnému druhu nebo ne, a také jsou schopny navrhovat hypotézy o fylogenetických vztazích mezi nimi..
Kromě toho má DNA sekvenování uplatnění v oblasti medicíny a diagnostiky. Existují například cenově dostupné a přístupné systémy, které nám díky sekvenování umožňují vyhodnotit tendenci vyvíjet určité nemoci (např. Rakovinu) pomocí tzv. Jednoduchých nukleotidových polymorfismů (SNP)..
Šetření kriminalistického a forenzního typu byla také obohacena o techniky sekvenování a může být použita jako spolehlivý důkaz účasti určitého jednotlivce na trestném činu..
Odkazy
- Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Sekvence sekvencerů: historie sekvenování DNA. Genomika, 107(1), 1-8.
- Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Další generace sekvenční revoluce a její vliv na genomiku. Buňka, 155(1), 27-38.
- Levy, J. (2010). Vědecké soupeření. Od projektu Galileo po projekt lidského genomu. Paraninfo Editorial.
- Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). Sekvenování DNA s inhibitory ukončujícími řetězec. Sborník národní akademie věd, 74(12), 5463-5467.
- Schuster, S. C. (2007). Sekvenování další generace transformuje dnešní biologii. Přírodní metody, 5(1), 16.
- Xu, J. (Ed.). (2014). Sekvenování další generace. Caister Academic Press.