Vlastnosti proteinázy K, enzymatická aktivita a aplikace



proteinázy K je enzym, který patří do skupiny serinových proteáz, to znamená, že má ve svém aktivním katalytickém centru aminokyselinu serinu a má funkci štěpení peptidových vazeb hydrolýzou. Tento enzym zase patří do rodiny proteinů subtilisinů (peptidáza S8)..

Proteináza K má molekulovou hmotnost (MW) 28,900 daltonů a byla poprvé izolována v roce 1974 z extraktů z houby Engyodontium album, dříve známé názvem Tritirachium album Limber.

Představuje vysokou proteolytickou kapacitu, která je schopna degradovat přítomnost keratinu ve vlasech. Slovo keratin v angličtině je napsáno "keratin", proto se nazývá "proteináza K".

Vzhledem ke své vysoké schopnosti štěpit nativní proteiny je tento enzym použitelný v různých metodách molekulární biologie. Používá se především k izolaci a přípravě nukleových kyselin s vysokou molekulovou hmotností (MW)..

Proteináza K působí uvolňováním jaderné DNA, zatímco ničí proteiny a inaktivuje RNázy a DNázy, to znamená, že vylučuje nukleázy v preparátech DNA a RNA..

Na druhou stranu bylo zjištěno, že proteináza K může hydrolyzovat některé denaturované nativní proteiny, což vyvolalo zájem výzkumníků o její použití při studiu prionových proteinů (PrPC)..

Nicméně navzdory své vysoké proteolytické účinnosti existují proteiny, které jsou rezistentní vůči působení proteinázy K. Mezi nimi jsou některé abnormální proteiny zvané priony (PrPSc) spojené s přenosnými spongiformními encefalopatiemi.

Index

  • 1 Charakteristika proteinázy K
  • 2 Enzymatická aktivita
  • 3 Aplikace
  • 4 Výhody proteinázy K
  • 5 Proteiny rezistentní na proteinázu K
  • 6 Odkazy

Charakteristika proteinázy K

Proteináza K má terciární strukturu tvořenou třemi vrstvami, přičemž mezi dvěma vrstvami spirály se rozkládá p-list o sedmi řetězcích. Protože patří do rodiny peptidáz S8, je charakterizován tím, že má v aktivním místě katalytickou triádu, jejíž sekvenční pořadí je (Asp, His a Ser), které je odlišuje od jiných skupin peptidáz..

Tento enzym ze skupiny serinových proteáz se vyznačuje hydrolýzou peptidových vazeb v blízkosti karboxylové skupiny alifatických a aromatických aminokyselin..

Na druhé straně je schopna působit v přítomnosti určitých korozivních látek, jako je dodecylsulfát sodný (SDS), Tris-HCL a EDTA, které se používají k usnadnění denaturace proteinů, což způsobuje ztrátu jejich přirozené struktury..

To je předběžný krok při přípravě proteinů pro elektroforetickou techniku. Rozsah pH, ​​při kterém proteináza K působí, je poměrně široký (2,0 až 12,0), s optimálním pH mezi 7,5 až 12,0 a jeho izoelektrický bod je 8,9. Jak lze pozorovat, je účinný proti velmi širokému rozsahu pH.

Další vlastností, která se vyznačuje proteinázou K, je její stabilita v přítomnosti vysokých teplot (50 - 60 ° C)..

Enzymatická aktivita

Proteináza K potřebuje přítomnost vápenatých iontů, i když to nemá vliv na její aktivitu, pokud je nezbytné udržet její stabilitu.

Aby proteináza K provedla úplné štěpení substrátu, je nutná přibližná doba kontaktu mezi 5 minutami a 2 hodinami..

V tomto smyslu však Daza et al., Porovnávali čistotu DNA získané v několika časech vystavení proteináze K a dospěli k závěru, že prodloužená inkubace (až 24 hodin) významně zlepšuje kvalitu DNA..

Nyní, ve vztahu k koncentraci, která se používá v enzymovém enzymu K v různých protokolech, lze říci, že je velmi různorodá.

Lze jej použít od velmi nízkých koncentrací (5 μg / ml) až po koncentrace 500 μg / ml. Nejčastější pracovní koncentrace se však pohybují mezi 50-100 μg / ml, zejména pro trávení proteinů a inaktivaci nukleáz. I když je pro léčbu tkání vyžadována koncentrace 2 mg / ml.

Aplikace

Jeho aplikace jsou velmi široké a lze je shrnout takto:

-Používá se při štěpení proteinů a extrakci DNA několika způsoby, jako jsou: vysolení, PK-SDS, cetyl-trimethylamoniumbromid (CTAB), modifikovaný octan draselný a extrakce jodidem sodným..

-Inaktivace nukleáz (RNázy a DNázy).

-V hybridizační technice in situ (HIS), k usnadnění uvolnění nukleové kyseliny, kromě odstranění nežádoucích proteinů.

-Modifikace proteinu.

-Na úrovni výzkumu, v různých studiích.

Výhody proteinázy K

Bylo provedeno několik srovnávacích studií mezi technikami extrakce DNA s použitím proteinázy K, přičemž jiné, které ji nepoužívají, a všechny dospěly k závěru, že při použití tohoto enzymu je větší přínos. Mezi výhodami lze zmínit následující:

-Získá se DNA s vysokou molekulovou hmotností vysoké kvality a čistoty.

-Extrahovaná DNA je stabilní až 3 měsíce.

Extrahovaná DNA může být použita v následujících technikách: Southern blot, polymerázová řetězová reakce (PCR), mimo jiné elektroforéza..

Proteiny rezistentní na proteinázu K

Různé studie dospěly k závěru, že priony (abnormální PrPSc toxické proteiny) se liší od proteinů PrPC (nativních), protože jsou rezistentní vůči působení proteinázy K, zatímco PrPC jsou citlivé na jejich působení.

Jiní autoři popsali, že ve struktuře PrPSc jsou citlivé části a další rezistentní na proteinázu K. Nicméně obě části jsou stejně toxické a infekční..

Na druhé straně, Bastian a spolupracovníci v roce 1987 izolovali 4 proteiny 28, 30, 66 a 76 kda od druhu Spiroplasma mirum. Všechny byly rezistentní vůči působení proteinázy K a také měly křížovou reakci s některými priony.

Je známo, že tento druh může způsobit šedý zákal a významné neurologické poškození a díky vědeckým poznatkům Bastiana, mezi jinými vyšetřováními, byl učiněn pokus o spojení tohoto mikroorganismu s přenosnými spongiformními encefalopatiemi..

Etiologie této degenerativní neurologické patologie je však dnes připsána prionům.

V tomto smyslu Butler a spolupracovníci v roce 1991 identifikovali a charakterizovali třídu proteinů K rezistentních na proteinázu 40 Kda ze dvou kmenů Mycoplasma hyorhinis. Tento patogen ovlivňuje prasata, infikuje jejich tkáně, ale v tomto případě nedošlo k žádné křížové reakci s testovanými priony.

K objasnění mnoha neznámých je zapotřebí dalšího výzkumu.

Odkazy

  1. Bastian F, Jennings R., a Gardner W. 1987. Antisérum proti vláknitému proteinu spojenému se scrapie zkříženě reaguje s Spiroplasma mirum proteinů fibril. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Vyhodnocení metody extrakce a čištění DNA ze svalové tkáně fixované ve formaldehydu z neidentifikovaných mrtvol.  Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, a Mcgarrity G. Identifikace a charakterizace proteinů rezistentních na proteinázu v členech třídy Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Porovnání dvou protokolů pro extrakci DNA z. \ T Trypanosoma cruzi pěstované v axenickém médiu. Peru. Med. Exp  2014; 31 (2): 222-227. Dostupné na: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E a Palma W. Stanovení účinnosti pěti protokolů extrakce DNA z parafínového materiálu pro molekulární studie. Rev Méd Univ Kostarika. 2007; 1 (1): 10-19.