DNA mikročipy v tom, co tvoří, postup a aplikace



A DNA microarray, Také se nazývá DNA čip nebo DNA microarray, je složen ze série DNA fragmentů ukotvených na fyzickém nosiči variabilního materiálu, buď plastu nebo skla. Každý kus DNA představuje sekvenci komplementární ke specifickému genu.

Hlavním cílem mikročipů je srovnávací studie exprese určitých zájmových genů. Například je běžné, že tato technika je aplikována na dva vzorky - jeden za zdravých a jeden patologický - za účelem identifikace, které geny jsou exprimovány a které nejsou ve vzorku, který představuje stav. Uvedeným vzorkem může být buňka nebo tkáň.

Obecně lze expresi genů detekovat a kvantifikovat díky použití fluorescenčních molekul. Manipulace s čipy je ve většině případů prováděna robotem a současně může být analyzován velký počet genů.

Tato inovativní technologie je užitečná pro širokou škálu oborů, od lékařské diagnostiky až po různé molekulárně biologické studie v oblasti proteomiky a genomiky..

Index

  • 1 Z čeho se skládá??
    • 1.1 Typy microarray
  • 2 Postup
    • Izolace 2.1 RNA
    • 2.2 Produkce a značení cDNA
    • 2.3 Hybridizace
    • 2.4 Systémové čtení
  • 3 Aplikace
    • 3.1 Rakovina
    • 3.2 Další nemoci
  • 4 Odkazy

Z čeho se skládá??

DNA mikročipy (deoxyribonukleová kyselina) jsou souborem specifických segmentů DNA připojených k pevné matrici. Tyto sekvence jsou komplementární k genům, které si přejí být studovány, a může existovat až 10 000 genů na cm2.

Tyto charakteristiky umožňují systematické a masivní studium genové exprese organismu.

Informace, které buňka potřebuje pro svou činnost, jsou kódovány v jednotkách nazývaných "geny". Některé geny obsahují instrukce pro tvorbu základních biologických molekul zvaných proteiny.

Gen je exprimován, pokud je jeho DNA transkribována na intermediární molekulu mediátorové RNA a exprese genu se může lišit v závislosti na úrovni transkripce tohoto segmentu DNA. V některých případech může být změna v expresi ukazatelem onemocnění.

Princip hybridizace umožňuje provoz mikročipů. DNA je molekula složená ze čtyř typů nukleotidů: adenin, thymin, guanin a cytosin.

Pro vytvoření dvojité helikální struktury je adenin seskupen s thyminem a cytosinem s guaninem. Dva komplementární řetězce tak mohou být spojeny vodíkovými vazbami.

Druhy mikročipů

Pokud jde o strukturu mikročipů, existují dvě varianty: personalizované sloučeniny komplementární DNA nebo oligonukleotidy a komerční mikročipy s vysokou hustotou vyráběné komerčními společnostmi, jako je Affymetrix GeneChip.

První typ microarray umožňuje analýzu RNA ze dvou různých vzorků na jediném čipu, zatímco druhá varianta je komerčního typu a má velký počet genů (například Affymetrix GeneChip má přibližně 12 000 lidských genů) umožňující analýzu jeden vzorek.

Postup

Izolace RNA

Prvním krokem k provedení experimentu s využitím technologie microarray je izolace a purifikace molekul RNA (může to být messenger RNA nebo jiné typy RNA).

Pokud chcete porovnat dva vzorky (zdravý versus nemocný, kontrola vs. léčba, mimo jiné), měla by být provedena izolace molekuly v obou tkáních..

Produkce a značení cDNA

Následně se RNA podrobí procesu reverzní transkripce v přítomnosti značených nukleotidů a získá se tak komplementární DNA nebo cDNA..

Štítek může být fluorescenční a musí být diferencovatelný mezi oběma tkáněmi, které mají být analyzovány. Tradičně se používají fluorescenční sloučeniny Cy3 a Cy5, protože emitují fluorescenci při různých vlnových délkách. V případě Cy3 se jedná o barvu blízkou červené a Cy5 odpovídá spektru mezi oranžovou a žlutou.

Hybridizace

CDNA se smísí a inkubace se provede v DNA mikročipu, aby se umožnila hybridizace (tj. Vazba) cDNA z obou vzorků s částí DNA imobilizovanou na pevném povrchu mikročipu..

Vyšší procento hybridizace se sondou v mikročipu je interpretováno jako větší tkáňová exprese odpovídající mRNA.

Systémové čtení

Kvantifikace exprese se provádí začleněním čtecího systému, který přiřazuje kód barvy množství fluorescence emitované každou cDNA. Například, jestliže červená je používána označit patologický stav a to se hybridizuje ve větším poměru, červená složka bude převládající.

S tímto systémem je možné znát nadměrnou expresi nebo represi každého analyzovaného genu v obou vybraných podmínkách. Jinými slovy, můžete znát transkriptome vzorků hodnocených v experimentu.

Aplikace

V současné době jsou mikročipy považovány za velmi silné nástroje v oblasti medicíny. Tato nová technologie umožňuje diagnostiku onemocnění a lepší pochopení toho, jak je genová exprese modifikována za různých zdravotních podmínek.

Kromě toho umožňuje porovnání kontrolní tkáně a tkáně ošetřené určitým léčivem, aby bylo možné studovat účinky případné lékařské léčby..

Za tímto účelem se normální stav a nemocný stav srovnávají před a po podání léčiva. Při studiu účinku léčiva na genom in vivo máte lepší přehled o mechanismu jeho působení. Kromě toho lze pochopit, proč některé konkrétní léky vedou k nežádoucím vedlejším účinkům.

Rakovina

Rakovina překonává seznam nemocí studovaných s DNA microarrays. Tato metosologie byla použita pro klasifikaci a prognózu onemocnění, zejména v případech leukémie.

Oblast výzkumu tohoto stavu zahrnuje kompresi a charakterizaci molekulárních bází nádorových buněk za účelem nalezení vzorců genové exprese, které mají za následek selhání regulace buněčného cyklu a procesů buněčné smrti (nebo apoptózy)..

Jiné nemoci

Pomocí mikročipů jsme byli schopni objasnit profily diferenciální exprese genů v lékařských stavech alergií, primárních imunodeficiencí, autoimunitních onemocněních (jako je revmatoidní artritida) a infekčních onemocněních..

Odkazy

  1. Bednar, M. (2000). Technologie DNA microarray a aplikace. Lékařský vědecký monitor, 6(4), MT796-MT800.
  2. Kurella, M., Hsiao, L., Yoshida, T., Randall, J. D., Chow, G., Sarang, S., ... & Gullans, S. R. (2001). DNA microarray analýza komplexních biologických procesů. Journal of American Society of nefrology, 12(5), 1072-1078.
  3. Nguyen, D.V., Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, R. J. (2002). Experimenty s mikročipy DNA: biologické a technologické aspekty. Biometrie, 58(4), 701-717.
  4. Plous, C. V. (2007). DNA mikročipy a jejich aplikace v biomedicínském výzkumu. Časopis CENIC. Biologické vědy, 38(2), 132-135.
  5. Wiltgen, M., & Tilz, G. P. (2007). Analýza DNA microarray: principy a klinický dopad. Hematologie, 12(4), 271-287.