Nadace močoviny, příprava a použití

močovinový vývar je kapalné kultivační médium, používané k prokázání přítomnosti enzymu ureázy v určitých mikroorganismech. Ureáza je mikrobiální enzym, který je produkován konstitutivně, to znamená, že je syntetizován nezávisle na tom, zda je substrát, na kterém působí, přítomen či nikoliv..

Funkce ureázy souvisí s rozkladem organických sloučenin. Ne všechny mikroorganismy jsou schopny tento enzym syntetizovat, proto jeho stanovení v laboratoři umožňuje identifikovat určité bakteriální kmeny a dokonce rozlišovat mezi druhy stejného rodu..

Existují dva typy testu močoviny: Stuart a Christensen. Liší se svým složením a citlivostí. První je zvláštní ukázat velké množství ureázy produkované druhy rodu Proteus.

Druhý je citlivější a může detekovat malá množství ureasy generované pozdějšími jinými bakteriálními rody, jako je Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter a Mycobacterium..

Stuart urea bujón se skládá z močoviny, chloridu sodného, ​​fosforečnanu draselného, ​​fosforečnanu draselného, ​​kvasničného extraktu, fenolové červeně a destilované vody..

Zatímco Christensenův bujón nebo agarová močovina se skládá z peptonů, chloridu sodného, ​​fosforečnanu draselného, ​​glukózy, močoviny, fenolové červeně, destilované vody a agaru. Posledně uvedené pouze v případě, že se jedná o pevné médium.

Index

• 1 Nadace
  • 1.1 Stuart urea bujón
  • 1.2 Christensenův bujón nebo agarová močovina
  • 1.3 Interpretace obou médií (Stuart a Christensen)
• 2 Příprava
  • 2.1 Stuart urea bujón
  • 2.2 Christensenův bujón nebo agarová močovina
• 3 Použití
• 4 Zasetí testu močoviny
• 5 Kontrola kvality
• 6 Odkazy

Nadace

Enzym ureasa hydrolyzuje močovinu za vzniku oxidu uhličitého, vody a dvou molekul amoniaku. Tyto sloučeniny reagují za vzniku konečného produktu zvaného uhličitan amonný.

Stuart urea bujón

Bujón Stuartovy močoviny je pufrován s pH 6,8. Proto musí být mikroorganismus schopen tvořit velké množství amoniaku, aby zčervenal na fenol. Hodnota pH musí vzrůst nad 8 ° C.

Proto je močovinový bujón Stuart selektivní pro druhy Proteus, což dává pozitivní výsledky v inkubaci 24 až 48 hodin a není účinný pro bakterie, které produkují malá množství ureázy nebo které pomalu hydrolyzují močovinu..

Je to proto, že druhy Proteus jsou schopny používat močovinu jako zdroj dusíku. Naproti tomu jiné bakterie produkující ureázu potřebují další zdroj.

Pérez et al. (2002) zjistili, že Stuartův močovinový bujón byl stejně účinný jako močovinový agar z Christensenu, aby se stanovila ureáza v kmenech kvasinek rodů Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon a Saccharomyces..

Autoři studie tvrdí, že dosáhli 100% shody s oběma médii (Stuart a Christensen) inkubací po dobu 24 a 48 hodin; učinit podmínku, že vzali stejně pozitivní kmeny, které dokázaly proměnit média v silnou růžovo-fuchsiovou barvu.

Toto objasnění je nezbytné, protože Lodder (1970) potvrdil, že téměř všechny kvasinky dokáží umístit zkosení močovinového agaru Christensen do světle růžové barvy. Je to proto, že mohou hydrolyzovat močovinu v minimálních množstvích a vytvářet aminy oxidační dekarboxylací aminokyselin na povrchu. To by nemělo být vykládáno jako pozitivní.

Bujón nebo močovinový agar z Christensenu

Christensenův močovinový bujón nebo agar je méně pufrovaný a je schopen detekovat malá množství amoniaku. Kromě toho je toto médium obohaceno peptony a glukózou. Tyto sloučeniny způsobují, že se vyvíjejí další mikroorganismy produkující ureázu, které nerostou v bujónu Stuart.

Podobně test Christensenova močoviny nabízí rychlejší výsledky, zejména pro Proteus, který je schopen poskytnout velmi pozitivní výsledky za pouhých 30 minut jako minimální dobu a až 6 hodin jako maximální dobu..

Zbytek mikroorganismů produkujících ureázu se po 6 hodinách a po 24, 48, 72 hodinách nebo více podařilo změnit barvu média a dokonce i některé kmeny mohou po 5 nebo 6 dnech způsobit slabé reakce..

Interpretace obou médií (Stuart a Christensen)

Médium je původně žlutooranžové barvy a pozitivní reakce změní barvu média na růžovou fuchsii. Intenzita barvy je přímo úměrná množství vyrobeného amoniaku.

Negativní reakce opustí médium původní barvy s výjimkou kvasinek, které mohou poskytnout světle růžový agar s Christensenovým močovinou..

Příprava

Stuart urea bujón

Zvažte potřebné gramy podle označení obchodního domu. Rozpustí se ve sterilní destilované vodě. Nepoužívejte teplo k rozpuštění, protože močovina je citlivá na teplo.

K sterilizaci se používá metoda membránové filtrace. K tomu se používá filtr Millipore s póry o průměru 0,45 μ. Nepoužívejte autokláv. Jakmile je roztok zfiltrován, je distribuován ve sterilních zkumavkách. Aby se dosáhlo spolehlivých výsledků, musí být převedeno mezi 1,5 ml a minimálně 3 ml jako maximální množství na zkumavku..

Uchovávejte v chladničce a před použitím temperujte.

Pokud není k dispozici metoda filtrace, médium by mělo být použito okamžitě, aby bylo dosaženo spolehlivých výsledků.

Další způsob přípravy bujónu Stuart močoviny je následující:

Některé komerční domy prodávají polovinu základny pro zkoušku močoviny, bez močoviny.

Částka uvedená obchodním domem se zváží. Rozpustí se v destilované vodě a sterilizuje se v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut. Nechte trochu odpočívat a když je médium teplé, přidejte 100 ml roztoku močoviny připraveného ve 20% a sterilizujte filtrací.

Distribuuje se ve sterilních zkumavkách, jak bylo popsáno výše.

Bujón nebo močovinový agar z Christensenu

-Příprava roztoku močoviny

Naváží se 29 g dehydrované močoviny a rozpustí se ve 100 ml destilované vody. K sterilizaci použijte filtrační metodu. Nepoužívejte v autoklávu.

-Agar s močovinovou bází

24 g dehydratovaného agaru se rozpustí v 950 ml destilované vody. Sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut. Nechte stát, dokud nedosáhne teploty 50 ° C a přidejte předem připravenou močovinu asepticky.

Nalijte 4 až 5 ml do sterilních zkumavek a nakloňte až do ztuhnutí. Měla by být dlouhá flétna.

Toto médium může být také připraveno v kapalné formě.

Použití

Test močoviny je velmi účinný při rozlišování rodu Proteus od jiných rodů čeledi Enterobacteriaceae, vzhledem k rychlé reakci, kterou poskytuje Proteus..

Pokud se používá složení Christensen, test pomáhá rozlišovat mezi druhy stejného rodu. Například, S. haemolyticus a S. warneri sna Staphylococcus koaguláza negativní a betahemolytická, ale liší se v tom S. haemolyticus je to negativní močovina a S. warneri je to pozitivní močovina.

Na druhé straně, McNulty úspěšně použil 2% Christensen urea bujón ke studiu přítomnosti Helicobacter pylori ve vzorcích biopsií odebraných ze sliznice žaludku (antrální oblast).

Přítomnost H. pylori dokazuje to pozitivní test močoviny. Doba pozorování výsledků je přímo úměrná množství přítomných mikroorganismů.

Jak je vidět, jedná se o jednoduchý způsob diagnostiky Helicobacter pylori v biopsiích žaludku.

Tento test je také užitečný k rozlišení druhů rodů Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus a Mycobacteria.

Setí test močoviny

Tyto dvě metody vyžadují pro optimalizaci výsledků silné mikrobiální inokulum. Bakteriální kolonie se s výhodou odebírají z krevních agarových a Sabouraudových agarových kvasinek s určitými výjimkami. Inokulum se emulguje v kapalném médiu.

Pro Stuartův močovinový bujón inkubovaný při 37 ° C po dobu 24 až 48 hodin, s vědomím, že se hledají pouze kmeny rodu Proteus, když je kmenem bakterie. Pro kvasinky může být inkubován při teplotě 37 ° C nebo při teplotě místnosti po dobu 24 až 48 hodin inkubace.

V případě močovinového bujónu Christensen inkubujte 24 hodin při 37 ° C. Pokud je test negativní, může být inkubován po dobu až 6 dnů. Pokud je test pozitivní před 6 hodinami, znamená to, že se jedná o kmen rodu Proteus.

V případě močovinového agaru Christensen je zkosení agaru silně inokulováno, bez propíchnutí. Bujón se inkubuje a interpretuje stejným způsobem.

Kontrola kvality

Kontrolní kmeny mohou být použity pro testování média, jako je Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 a Salmonella typhimurium.  První dvě musí přinést pozitivní výsledky a poslední dva negativní výsledky.

Odkazy

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Použití bujónu Stuart urea pro ureasový test, jako test v diagnóze kvasinek. Soc. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Dostupné na: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. ed. Redakční Panamericana. Buenos Aires Argentina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydání. Redakční Panamericana S.A. Argentina.
5. Laboratoře Britania. Christensen Medio (Urea agar base) 2015. K dispozici na adrese: britanialab.com