Charakteristiky a příprava bakteriálního nátěru



 bakteriální stěr je rozšíření ve formě tenké vrstvy suspenze bakteriálních mikroorganismů, která se provádí na průhledné skleněné desce nebo sklíčkach, pro pozorování pod optickým mikroskopem.

Rozšíření ve formě filmu se provádí tak, aby mikroorganismy byly co nejvíce odděleny, protože pokud jsou seskupeny, pozorování není jasné..

Ve studii technik bakteriálních kultur se používají metody přípravy nátěrů, fixace a zbarvení, které jsou lépe analyzovány. Kvůli malé velikosti mikroorganismů, použití optického mikroskopu je nutně nutné pro jeho pozorování.

Optické mikroskopy jsou nepostradatelným nástrojem pro pozorování šmouh. Používají optické čočky a světlo umožňující vizualizaci vzorků s velkým zvětšením velikosti.

Živé buňky obecně nemají struktury, které jsou většinou zbarvené, viděné optickým mikroskopem, jsou to bezbarvé, průhledné vzorky a vykazují velmi malý vnitřní kontrast a okolí..

Pozorování pomocí mikroskopu s jednoduchým světelným polem, bez použití pomocných technik barvení, je velmi omezené a používá se pouze v některých případech, jako je tomu při pozorování pohybu mikroorganismů.

Pro optimální sledování mikroorganismů je třeba dosáhnout rovnováhy mezi kontrastem a rozlišením. Podrobnosti o buňkách nelze pozorovat pod mikroskopem, a to ani při vysokém rozlišení; použití barviv je vyžadováno technikami barvení, které poskytují kontrast pro pozorování.

Index

  • 1 Charakteristika kvalitního bakteriálního nátěru
    • 1.1 Vynikající kontrast
    • 1.2 Dobrá oprava
    • 1.3 Dobré barvení
  • 2 Příprava
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 B. Fixace
    • 2.3 C. Jednoduché barvení
    • 2.4 D. Konečné uchování nátěru
  • 3 Odkazy

Charakteristika kvalitního bakteriálního nátěru

Vynikající kontrast

Pro dosažení vynikajícího kontrastu se nazývají sofistikované mikroskopy mikroskop fázového kontrastu, diferenciální interference a mikroskop v tmavém poli. Tento typ mikroskopu se mimo jiné používá k pozorování bakteriálních struktur, jako jsou pláště a vlákna.

Barvení je jednoduchá technika pro zvýšení kontrastu, která je dosažena pomocí mikroskopu s jasným polem. V této technice mohou být použita různá barviva, která znatelně zlepšují pozorování pod mikroskopem.

Barviva se provádějí přímo na nátěrech nebo extenzích suspenzí mikroorganismů na sklíčkach, předem vysušených a fixovaných..

Dobrá oprava

Fixace je technika, která se používá k zachování buněčných struktur; způsobuje inaktivaci mikroorganismů a adhezi ke sklu sklíčka. Existují různé způsoby fixace: tepelná fixace a chemická fixace.

Tepelná fixace

Jedná se o metodu nejpoužívanější při pozorování bakteriálního nátěru. Tato technika spočívá v průchodu bakteriální suspenze nátěru plamenem zapalovače. Tato technika je schopna zachovat vnější morfologii bakterií, ale ničí jejich vnitřní struktury.

Chemická fixace

Chemická fixace používá chemikálie při konzervaci, jako je formaldehyd nebo formaldehyd, ethanol a kyselina octová. Výhodou použití chemických fixačních činidel je, že je dosaženo zachování vnitřních buněčných struktur mikroorganismů.

Dobré barvení

Nejběžnější postupy barvení předem vysušeného a fixního nátěru jsou pozitivní nebo jednoduché barvení, diferenciální barvení a negativní barvení. Existují také speciální techniky pro barvení jednotlivých buněčných struktur (kapsle, spory, flagella)..

Pozitivní barvení nebo jednoduché barvení

Pozitivní nebo jednoduché barvení je nejpoužívanější technika barvení skvrn. Používá barviva, která mají schopnost vázat se na určité mikrobiální struktury, což jim umožňuje pozorovat pod mikroskopem.

Tato barviva mají chromoforické skupiny (barevný podíl) ve své chemické struktuře se střídavými dvojnými vazbami a jednoduchými vazbami (konjugace). Tyto vazby mohou zase navázat iontové nebo kovalentní vazby s některými buněčnými strukturami.

Barviva používaná v pozitivním nebo jednoduchém barvení jsou většinou chemické deriváty anilinu (barevné organické soli).

Na druhé straně mezi barvivy najdeme některé se základním pH a další s kyselým pH.

Základní barviva

V základních barvivech má chromoforová skupina pozitivní elektrický náboj. Drtivá většina prokaryotických mikroorganismů má neutrální vnitřní pH a jejich buněčný povrch je negativně nabitý. Prostřednictvím této elektrostatické interakce se chromofor váže na buňku a barví ji.

Příklady základních barviv jsou methylenová modř, fialový krystal, malachitová zelená, základní fuscin, safranin, mj..

Kyselá barviva

V kyselých barvivech má chromoforová skupina negativní elektrický náboj. Ty se používají pro barvení proteinů s pozitivně nabitými aminoskupinami. Příklady kyselých barviv jsou kyselina fuscin, růže bengálská, kongo červená a eosin.

Diferenciální barvení

Technika diferenciálního barvení spočívá v aplikaci dvou barviv různých barev nebo intenzity, aby se odlišily mikroorganismy pod mikroskopem. Barvení Gramovým barvením a rezistencí na alkohol-alkohol jsou nejpoužívanějšími diferenciálními barvivy v bakteriologii.

Gramové barvení se používá jako předběžný test, aby se poznal tvar, velikost, buněčné seskupení, kromě typu buněčné stěny. Pomocí testu Gramovým barvením se bakterie s buněčnou stěnou klasifikují jako grampozitivní bakterie a gramnegativní bakterie.

Negativní barvení

V této technice se používají chemická barviva, která nepronikají do buněčného interiéru, ale dělají to, že médium, ve kterém se mikroorganismy objevují jako černé pozadí.

V technice negativního barvení se nátěr provádí kapkou suspenze čínského inkoustu nebo nigrosinu, který po povolení sušení při pokojové teplotě vytváří film neprůhledný pro průchod světla. Tímto způsobem jsou mikroorganismy pozorovány jako světlé formy na tmavém pozadí.

Příprava

A. Šmouha

1.- Sklíčka dobře umyjte, osušte savým papírem a označte. Na štítku musí být uveden obsah přípravku, datum a jméno osoby, která je zpracovala.

2.- Zapalte zapalovač a očistěte očkovací smyčku v plameni, dokud se nerozpustí červená.

3.- Nechte rukojeť vychladnout.

4.- Vezměte zkumavku bakteriální kultury, odstraňte uzávěr a rychle projděte ústem zkumavky v blízkosti plamene zapalovače (plamen)..

5.- Vložte očkovací smyčku do zkumavky obsahující bakteriální kulturu a odeberte vzorek.

6.- Je-li kultura v kapalném médiu, umístěte vzorek odebraný s rukojetí do středu sklíčka a opatrně jej rozprostřete v kruhu o průměru přibližně 2 cm..

7.- Znovu sterilizujte očkovací smyčku.

8.- Nechte uschnout nátěr ve vzduchu.

9.- Opakujte kroky 3 až 8 třikrát.

10.- Pokud je kultura v pevném médiu, měla by se na sklíčko předem umístit kapka destilované vody. To se provádí za účelem smíchání malého vzorku kultury odebrané s rukojetí inokulace podle indikací kroků 2 až 5 (stavy asepsy)..

11.- Zředěný vzorek prodlužte kapkou vody na sklíčku a třikrát opakujte.

B. Fixace

1.- Do suchých nátěrů - z kultur v kapalném médiu - se přidají dvě kapky methanolu nebo absolutního ethanolu.

2.- Nechte sušení ve vzduchu od zapalovače.

3.- Pokud nátěr pochází z kultury v pevném médiu, suchý nátěr se fixuje teplem a dvakrát až třikrát prochází nejteplejší oblastí plamene zapalovače..

4.- Dotkněte se spodní části stěrky hřbetní částí levé ruky (pro praváky, jinak použijte pravou ruku) a zkontrolujte, zda je zima.

C. Jednoduché barvení

1.- Přidejte 2 kapky zvoleného barviva do nátěru a nechte působit po dobu požadovanou ve specifických protokolech každého barviva (obvykle mezi 1 a 5 minutami)..

2.- Některá barviva vyžadují použití tepla pro jejich aktivaci, v takovém případě je nutné být velmi opatrný při zahřívání sklíčka v plameni zapalovače (manipulovat s ním pinzetou a vyhnout se varu). Přehřátí nátěru může zničit buňky, které chcete pozorovat.

3.- Přebytečné barvivo se odstraní promytím destilovanou vodou z picety. Odstraňte prací vodu jemným poklepáním na podložku na jejím okraji, nakloněnou na pracovním stole.

4.- Nechte sušení vzduchu.

5.- V závislosti na typu pozorování se v této fázi používá nebo nepoužívá krycí sklíčko. Krycí sklíčko chrání a chrání nátěr. Pokud se v této fázi provede ponoření do oleje, nepoužije se krycí sklíčko, ale nátěr se nedá zachovat.

D. Konečné uchování nátěru

1.- Ponořte stěr postupně do každého z níže uvedených roztoků po dobu minimálně 5 minut. Účelem těchto "koupelí" je nechat stěr úplně dehydratovaný. Každá reagencie musí být vypuštěna před zavedením nátěru do další lázně.

Pořadí dehydratačních lázní je následující:

  1. Ethanol 70%
  2. 95% ethanol
  3. Čistý aceton
  4. Směs aceton-xylol 1: 1
  5. Xilol

Poté nechte sušit vzduch.

2. - Namontujte krycí sklíčko, nejlépe 22 × 22 mm, s použitím kanadského balzámu nebo jiným způsobem montáže.

Odkazy

  1. Briggs, G. (1965). Kauzální faktory v mikrobiologických laboratorních nehodách a infekcích. US Army Biological Laboratories. Fort Detrick.
  2. Cappucino, J.G. a Welch, C.T. (2017). Mikrobiologie: Laboratorní manuál. Pearson.
  3. Holt, J.G. Editor (1977). Kratší Bergeyho manuál determinativní bakteriologie. 8th Baltimore: Williams a Wilkins Co.
  4. Johnson, T.R. a případ; C.L. (2018). Laboratorní experimenty v mikrobiologii. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Diagnostická mikrobiologie. 14th St. Louis, USA: Elsiever, Inc..