Funkce restrikčních enzymů, mechanismus účinku, typy a příklady



restrikční enzymy jsou to endonukleázy používané určitými archaeami a bakteriemi, které inhibují nebo "omezují" šíření virů uvnitř nich. Oni jsou obzvláště obyčejní v baktériích a jsou část jejich obranného systému proti cizí DNA známé jako restrikční / modifikační systém.

Tyto enzymy katalyzují řezání dvouvláknové DNA na specifických místech, reprodukovatelně a bez použití další energie. Většina vyžaduje přítomnost kofaktorů, jako je hořčík nebo jiné divalentní kationty, i když některé vyžadují také ATP nebo S-adenosylmetionin..

Restrikční endonukleázy byly objeveny v roce 1978 Danielem Nathansem, Arberem Wernerem a Hamiltonem Smithem, kteří obdrželi Nobelovu cenu za medicínu za jejich objev. Její název obvykle pochází z organismu, kde je poprvé pozorován.

Tyto enzymy jsou široce používány při vývoji metod klonování DNA a dalších strategií molekulární biologie a genetického inženýrství. Jeho vlastnosti rozpoznávání specifických sekvencí a schopnost řezat sekvence v blízkosti rozpoznávacích míst z nich činí silné nástroje v genetickém experimentování.

Fragmenty vytvořené restrikčními enzymy, které působily na konkrétní molekulu DNA, mohou být použity k vytvoření "mapy" původní molekuly pomocí informací o místech, kde enzym štěpí DNA..

Některé restrikční enzymy mohou mít stejné rozpoznávací místo v DNA, ale nemusí jej nutně snižovat stejným způsobem. Existují tedy enzymy, které dělají řezy, které zanechávají tupé konce, a enzymy, které štěpí a zanechávají kohezní konce, které mají různé využití v molekulární biologii.

V současné době existují stovky různých komerčně dostupných restrikčních enzymů, které nabízejí různé komerční domy; tyto enzymy fungují jako "vlastní" molekulární nůžky pro různé účely.

Index

  • 1 Funkce
  • 2 Mechanismus působení
  • 3 Typy
    • 3.1 Restrikční enzymy typu I
    • 3.2 Restrikční enzymy typu II
    • 3.3 Restrikční enzymy typu III
    • 3.4 Restrikční enzymy typu IV
    • 3.5 Restrikční enzymy typu V
  • 4 Příklady
  • 5 Odkazy

Funkce

Restrikční enzymy slouží opačné funkci polymeráz, protože hydrolyzují nebo rozkládají esterovou vazbu uvnitř fosfodiesterové vazby mezi sousedními nukleotidy v nukleotidovém řetězci..

V molekulární biologii a genetickém inženýrství jsou široce používanými nástroji pro konstrukci expresních a klonovacích vektorů, jakož i pro identifikaci specifických sekvencí. Jsou také užitečné pro konstrukci rekombinantních genomů a mají velký biotechnologický potenciál.

Nedávné pokroky v genové terapii v současné době využívají restrikčních enzymů k zavedení určitých genů do vektorů, které jsou nositeli transportu těchto genů do živých buněk, a které mají pravděpodobně schopnost být vloženy do buněčného genomu, aby mohly být prováděny. trvalé změny.

Mechanismus působení

Restrikční enzymy mohou katalyzovat řezání dvouvláknové DNA, i když některé jsou schopny rozpoznat jednořetězcové DNA sekvence a dokonce RNA. Řez nastane po rozpoznání sekvencí.

Mechanismus účinku spočívá v hydrolýze fosfodiesterové vazby mezi fosfátovou skupinou a deoxyribózou v hlavním řetězci každého řetězce DNA. Mnohé enzymy jsou schopny štěpit na stejném místě, které rozpoznávají, zatímco jiné štěpí mezi 5 a 9 páry bází před nebo po něm..

Normálně tyto enzymy štěpí na 5 'konci fosfátové skupiny, což vede ke vzniku DNA fragmentů s 5' fosforylovým koncem a terminálním 3 'hydroxylovým koncem.

Protože proteiny nepřicházejí do přímého kontaktu s rozpoznávacím místem v DNA, musí být postupně přemístěny, dokud nedosáhnou specifického místa, například pomocí "posuvných" mechanismů na řetězci DNA..

Během enzymatického řezu je fosfodiesterová vazba každého z řetězců DNA umístěna v jednom z aktivních míst restrikčních enzymů. Když enzym opouští místo rozpoznávání a řezání, činí tak prostřednictvím nespecifických přechodných asociací.

Typy

V současné době je známo pět typů restrikčních enzymů. Níže uvádíme stručný popis každého z nich:

Restrikční enzymy typu I

Tyto enzymy jsou velké pentamerní proteiny se třemi podjednotkami, restrikcí, methylací a další pro rozpoznání sekvencí v DNA. Tyto endonukleázy jsou multifunkční proteiny schopné katalyzovat restrikční a modifikační reakce, mají ATPázovou aktivitu a také DNA topoizomerázu..

Enzymy tohoto typu byly první endonukleázy, které byly objeveny, byly poprvé purifikovány v šedesátých letech a od té doby byly studovány s velkou hloubkou.

Enzymy typu I nejsou široce používány jako biotechnologický nástroj, protože místo štěpení může být v místě variabilní vzdálenosti až 1000 párů bází od místa rozpoznávání, což je činí nespolehlivými z hlediska experimentální reprodukovatelnosti..

Restrikční enzymy typu II

Jsou to enzymy složené z homodimerů nebo tetramerů, které štěpí DNA v definovaných místech o délce 4 až 8 bp. Tato místa řezání jsou typicky palindromická, tj. Rozpoznávají sekvence, které jsou čteny stejným způsobem v obou směrech.

Mnohé restrikční enzymy typu II v bakteriích štěpí DNA, když rozpoznají svůj cizí charakter, protože nemají typické modifikace, které by měla mít vlastní DNA..

Jedná se o nejjednodušší restrikční enzymy, protože nevyžadují žádný jiný kofaktor než hořčík (Mg +) k rozpoznání a štěpení sekvencí DNA.

Přesnost restrikčních enzymů typu II při rozpoznávání a řezání jednoduchých sekvencí v DNA v přesných pozicích z nich činí jeden z nejpoužívanějších a nepostradatelných ve většině odvětví molekulární biologie..

Ve skupině restrikčních enzymů typu II se jedná o více podtříd klasifikovaných podle určitých vlastností, které jsou pro každou z nich jedinečné. Klasifikace těchto enzymů se provádí přidáním písmen abecedy, od A do Z podle názvu enzymu.

Některé z nejznámějších podtříd jsou:

Podtřída IIA

Jsou to dimery různých podjednotek. Rozeznávají asymetrické sekvence a používají se jako ideální prekurzory pro generování řezných enzymů.

Podtřída IIB

Skládají se z dalších dimerů a na obou stranách rozeznávají sekvenci DNA. Řezají oba řetězce DNA v rozsahu párů bází mimo rozpoznávací místo.

Podtřída IIC

Enzymy tohoto typu jsou polypeptidy s funkcí dělení a modifikace řetězců DNA. Tyto enzymy stříhají obě vlákna asymetricky.

Podtřída IIE

Enzymy této podtřídy jsou nejvíce používané v genetickém inženýrství. Mají katalytické místo a obecně vyžadují alosterický efektor. Tyto enzymy musí komunikovat se dvěma kopiemi jejich rozpoznávací sekvence, aby se dosáhlo účinného řezu. V této podtřídě jsou enzymy EcoRII a EcoRI.

Restrikční enzymy typu III

Restrikční endonukleázy typu III se skládají pouze ze dvou podjednotek, z nichž jeden je zodpovědný za rozpoznávání a modifikaci DNA, zatímco druhý je zodpovědný za řez sekvencí.

Tyto enzymy vyžadují pro své fungování dva kofaktory: ATP a hořčík. Restrikční enzymy tohoto typu mají dvě asymetrická rozpoznávací místa, translokují DNA způsobem závislým na ATP a štěpí ji mezi 20 až 30 bp sousedící s rozpoznávacím místem..

Restrikční enzymy typu IV

Enzymy typu IV se snadno identifikují, protože štěpí DNA methylačními značkami, jsou tvořeny několika různými podjednotkami, které jsou zodpovědné za rozpoznávání a dělení DNA sekvence. Tyto enzymy používají jako kofaktory GTP a divalentní hořčík.

Specifická místa pro řezání zahrnují nukleotidové řetězce se zbytky methylovaného nebo hydroxymethylovaného cytosinu v jednom nebo obou řetězcích nukleových kyselin..

Restrikční enzymy typu V

Tato klasifikace obsahuje enzymy typu CRISPER-Cas, které identifikují a štěpí specifické sekvence DNA z invazivních organismů. Enzymy Cas využívají vlákno CRISPER syntetizované naváděcí RNA k rozpoznání a napadení napadajících organismů.

Enzymy klasifikované jako typ V jsou polypeptidy strukturované enzymy typu I, II a II. Mohou řezat úseky DNA téměř jakéhokoliv organismu as velkým rozsahem délky. Jejich flexibilita a snadnost použití dělají tyto enzymy jeden z nejvíce obyčejně používaných nástrojů v genetickém inženýrství dnes spolu s enzymy typu II.

Příklady

Restrikční enzymy byly použity pro detekci polymorfismů DNA, zejména ve studiích populační genetiky a evolučních studií používajících mitochondriální DNA, za účelem získání informací o rychlostech substitucí nukleotidů..

V současné době mají vektory používané pro transformaci bakterií s různým účelem multiclonache místa, kde jsou nalezena rozpoznávací místa pro více restrikčních enzymů..

Mezi těmito enzymy jsou nejoblíbenější enzymy EcoRI, II, III, IV a V, získané a popsané poprvé E. coli; HindIII, od H. influenzae a BamHI B. amyloliquefaciens.

Odkazy

  1. Bickle, T. A., & Kruger, D. H. (1993). Biologie omezení DNA. Mikrobiologické recenze, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Poskytuje získanou rezistenci proti virům v prokaryotech. Věda, 315(Březen), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Molekulární perspektiva: restrikční endonukleázy. Kmenové buňky Základy rakoviny, 20, 190-191.
  4. Halford, S. E. (2001). Přeskakování, skákání a smyčkování restrikčními enzymy. Transakce biochemické společnosti, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Udržování druhové identity a kontrola speciací bakterií: nová funkce pro restrikční / modifikační systémy? Gene, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewinovy ​​geny XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones a Bartlett učení.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Ona, Q. (2015). Využití systémů CRISPR-Cas typu I a typu III pro editaci genomu. Výzkum nukleových kyselin, 1-12.
  8. Loenen, W. A. ​​M., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., & Wilson, G. G. (2013). Restrikční enzymy typu I a jejich příbuzní. Výzkum nukleových kyselin, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restrikce Endonukleázy při analýze a restrukturalizaci molekul DNA. Annu. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). Dna polymorfismus detekovatelný restrikční endonukleázou. Genetika, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Restrikční endonukleázy typu II a molekulárních věd o živé přírodě: struktura a mechanismus. CMLS Celulární a molekulární biologické vědy, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Jak se restrikční enzymy staly pracovníky molekulární biologie. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J., & Murray, K. (1976). Restrikční endonukleázy. Kritické recenze v biochemii, (Listopad), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Struktura a funkce homing endonukleázy. Čtvrtletní recenze biofyziky, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). Biologie omezení a anti-omezení. Aktuální stanovisko v mikrobiologii, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G.G., & Murray, N.E. (1991). Systémy omezení a modifikace. Annu. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomické vhledy do virulence Campylobacter jejuni a populační genetiky. Infect Dis. Transl. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Struktura a mechanismus multifunkčních restrikčních endonukleáz. Annu. Biochem., 50, 285-315.